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时间：2018-07-26
《抗原结合片段(fab)抗体制备技术》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、抗原结合片段(Fab)抗体制备技术一、原理基因工程抗体技术的基本原理是，首先从杂交瘤细胞、免疫脾细胞或外周血淋巴细胞中提纯 mRNA,逆转录为cDNA,再经PCR分别扩增抗体的重链和轻链可变区编编码基因，经适当方式将 二者连接形成单链抗体可变区基因片段(singlechainvariablefragments,ScFv)，在一 定的表达系统中得以表达。另外，重链和轻链可变区基因还能在同一宿主的两个载体中分别 表达，然后在胞浆内组装成单链抗体可变区片段(ScFv)，或二价抗体片段。这种单链抗体
2、在其N末端或C末端可进一步与毒素、葡萄球菌蛋白A、碱性磷酸酶、T细胞受体 及单链抗体片段本身融合，这些蛋白质既有抗原结合能力，又有其融合蛋白的生物活性，因 此这类蛋白被称为“双功能抗体”。二、材料、方法和结果(一)淋巴细胞的分离纯化1从小鼠脾脏分离制备淋巴细胞(1)将小鼠脾脏从小鼠腹腔取出，用002mol/LpH值74PBS(Hank′s液，无血清1640液均 可)洗涤外表面，去掉周围脂肪组织，置于200目不锈钢网膜中，此网膜事先放在一个高压后 的平皿中，平皿中加入10mlPBS或Han
3、k′s液或1640液。(2)用5ml或10ml注射器中的针柄轻轻研磨脾脏，使淋巴细胞通过网膜流入平皿中，而取出余 下的深白色的脾包膜层。(3)加入PBS10~15ml轻轻冲洗网膜及平皿，取出网膜，用毛细吸管轻轻吹打均匀，置于15m l离心管中。(4)置离心机中，1500~2000r/min，室温离心10min，弃上清。(5)用PBS8ml重悬细胞沉淀，分装入8个Eppendorf管中，1500~2000r/min离心， 将细胞沉淀放置冰浴或存放-70℃以备用。注意：此步关键是
4、将脾脏组织捣碎，使脾细胞组织块分成单个细胞，以利于RNA提取。2从人外周血或骨髓中分离淋巴细胞(1)抽取抗凝血或骨髓，每毫升血加入5单位肝素，一般建库需要30~40ml血或10ml骨髓。(2)用等量Hank′s液或PBS稀释外周血，如使用骨髓可用15倍量稀释。(3)为了分离血中的淋巴细胞，首先在各试管中(10~15ml试管)加入3ml淋巴细胞分离液(上海 生化试剂厂)或进口分离液FicollPlaque(Pharmacia10A00107)，然后于每个试管中从 管壁轻轻加入5ml稀释后的
5、血液。(4)置低速台式离心机，2500r/min，离心20min。(5)此时可见试管中不同组分的条带，从上至下分别为血浆层(黄色)，淋巴细胞层(白色)， 分离液(无色)和红细胞层(红色)，用毛细吸管轻轻吸取淋巴细胞层，置于另一10~15ml离心 管中。(6)用PBS或生理盐水作等量稀释，1000r/min离心10min。(7)小心弃上清，按步骤(6)用PBS或生理盐水洗两次。(8)用PBS或生理盐水按每10ml血悬1ml的比例重悬沉淀，分装入Eppendorf管中，离心后将沉 淀保存
6、于-70℃或置于冰浴中以供RNA提取备用。3杂交瘤细胞的制备(1)杂交瘤细胞T25方瓶中长成单层后，将杂交瘤细胞轻轻吹下，置入15ml试管中。(2)在低速离心机上1000r/min离心10min，用PBS或生理盐水洗涤两次。(3)用PBS4ml或生理盐水重悬细胞沉淀于4个Eppendorf管中。离心弃上清，将沉淀物保存 于-70℃或置于冰浴中以供RNA提取备用。(二)总细胞RNA的提取在建库过程中，由于cDNA合成这一步将使用通用引 物oligodT，因此在总RNA提取这一步中，提取纯
7、化mRNA不是非常必要的。提取高纯度的总 细胞RNA足可以被用作cDNA合成的模板，目前提取RNA的方法很多，也有不少商业化的试剂盒 ，这里介绍两家公司的RNA提取试剂盒及其方法。1TRIZOL法(1)在上述方法中制备的带有细胞沉淀的Eppendorf管中加入1mlTRIZOL溶液，用手反复摇匀 至细胞碎块完全被裂解，如不易完全裂解，可用移液器带有1ml无菌吸头反复吹打、研磨， 至组织细胞完全裂解，液体基本澄清为止，必要情况下，可再次加入少许TRIZOL溶液。 (2)将上述Eppendor
8、f管置室温(25~27℃)静置15~20min后(也可置4℃较长时间)，每管加入0 2ml氯仿(02ml/ml)，在手中反复振荡摇匀，室温静置10min。(3)将Eppendorf管置于高速台式冷冻离心机，或将普通离心机事先置4℃冰箱预冷。在4℃ 12000r/min离心10min。(4)小心吸取上层水相置于另一无菌的新的Eppendorf管中，内含有提取的细胞总RNA。(5)于管中加入05ml异丙醇，室温沉淀10min或4℃沉淀30mi
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