流式细胞仪常用技术方法

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1、蚌埠医学院科研中心细胞周期/DNA分析（PI法）一、鞘液准备（至少3LPBS，提前一天准备）0.01M的PBS配制方法：800ml蒸馏水中溶解NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO40.24g；调节pH到7.2-7.4（用HCl或NaOH调节，各地蒸馏水的酸碱度不同），加蒸馏水定容至1L，0.22um滤膜过滤后，室温保存。二、制备一个阴性对照来设定流式细胞仪的取样参数和十字门的范围：没有染色的细胞（制备过程如下，仅不加抗体）三、实验步骤1.取对数期生长细胞，倒去培养液，胰酶适度消化细胞，用培养液吹打，1000rpm，

2、离心10min弃上清；2.PBS洗2次，加0.5ml吹匀，务必吹散；3.加入70%预冷乙醇中（标准做法是将细胞悬液加入预冷70％酒精），固定时可加入TritonX-100以增加膜的通透性）封口膜封口，4℃固定1-2h或过夜（可长至一个月）；4.1000rpm×10min离心收集细胞，PBS洗两次；5.用0.4mlPBS重悬细胞并转移至离心管中轻轻吹打；6.加入Rnase-A约3ul至终浓度50ug/ml，37℃水浴消化30min；7.加入PI约50ul至终浓度约为5-50ug/ml，室温避光染色30min；8.用300目滤网

3、过滤，上机检测。流式细胞仪第6页共6页蚌埠医学院科研中心细胞周期/DNA分析(BD公司CycleTESTPLUSDNAReagentKit)一、鞘液准备（至少3LPBS，提前一天准备）0.01M的PBS配制方法：800ml蒸馏水中溶解NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO40.24g；调节pH到7.2-7.4（用HCl或NaOH调节，各地蒸馏水的酸碱度不同），加蒸馏水定容至1L，0.22um滤膜过滤后，室温保存。二、制备一个阴性对照来设定流式细胞仪的取样参数和十字门的范围：没有染色的细胞（制备过程如下1-6）三、若做

4、DNA倍体分析，需另设附加对照管肿瘤细胞和外周血单核细胞的混合管，比例至少为2：1四、实验步骤1.将细胞消化后，用冷PBS洗细胞两次，300g×5min（若细胞数过少可提高转速到500g），为减少细胞损失可用1.5ml离心管离心；2.弃上清留大约50ul下面的液体防止碰到细胞团，加入1mlBufferSolution并低速混匀细胞。3.室温离心，300g×5min；4.重复2、3一次；5.弃上清留大约50ul下面的液体，加入1mlBufferSolution重悬细胞；6.计数细胞，用BufferSolution将细胞密度调为

5、1×106个/ml；7.染色：A．取0.5ml含细胞5×105个；B．每管加入250ulSolutionA，用手轻拍混匀（勿用漩涡混匀）；C．室温反应10min，保留SolutionA；D．加入200ulSolutionB，轻轻混匀；E．室温反应10min，保留SolutionA+B；F．加入200ul冷SolutionC，轻轻混匀，黑暗处2-8℃孵育10min；用50um尼龙网过滤细胞，加入上样管上流式分析（3h内分析完）。淋巴细胞亚群分析一、鞘液准备（至少3LPBS，提前一天准备）0.01M的PBS配制方法：800ml蒸

6、馏水中溶解NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO40.24g；调节pH到7.2-7.4（用HCl或NaOH流式细胞仪第6页共6页蚌埠医学院科研中心调节，各地蒸馏水的酸碱度不同），加蒸馏水定容至1L，0.22um滤膜过滤后，室温保存。二、制备一个阴性对照来设定流式细胞仪的取样参数和十字门的范围：没有染色的细胞（制备过程如下，仅不加抗体）三、实验步骤1.采集血液样品，取100ul抗凝全血加入每支试管中，注意不要碰到管壁。2.轻轻混匀，依次加入20ulIsotypeControl(如没有的话用没染色细胞代替)，另外几管加入

7、20μl荧光抗体。室温避光保存20分钟。3.加入1×红细胞溶解液450μl，涡旋混匀避光保存10min，待管内液体透亮，300-500g离心5min，去上清4.加PBS2mlPBS涡旋混匀，300-500g离心5min，弃上清，然后加0.5mlPBS摇匀。过300目尼龙网，4℃避光1h内上机检测；若不能及时上机，加入0.5ml含1%多聚甲醛的PBS，放4℃冰箱保存，48h内上机检测。AnnexinV/PI双染色法检测细胞凋亡（BD公司Annexin-FITC/PI试剂盒）细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目前早期识别仍有困难

8、。这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS流式细胞仪第6页共6页蚌埠医学院科研中心暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。AnnexinV是