实验十二 菠菜叶中叶绿素的提取和分离

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1、实验十二菠菜叶中叶绿素的提取和分离（07-05-26）一实验目的1．掌握从菠菜叶中提取叶绿素的方法；2．了解薄层层析的原理，掌握薄层层析的一般操作和定性鉴定方法二实验原理1．叶绿素提取高等植物体内的叶绿体色素有叶绿素和类胡萝卜素两类，主要包括叶绿素a(C55H72O5N4Mg)、叶绿素b(C55H70O6N4Mg)、β—胡萝卜素(C40H56)和叶黄素(C40H56O2)等4种。叶绿素a和叶绿素b为吡咯衍生物与金属镁的配合物，胡萝卜素是一种橙色天然色素，属于四萜类，为一长链共轭多烯，有α、β、γ三种异构体，其中，β异构体含量最多。叶黄素为一种黄色色素，与叶

2、绿素同存在于植物体中，是胡萝卜素的羟基衍生物，较易溶于乙醇，在乙醚中溶解度较小。根据它们的化学特性，可将它们从植物叶片中提取出来，并通过萃取、沉淀和色谱方法将它们分离开来。2．薄层色谱薄层层析是快速分离和定性分析微量物质的一种极为重要的实验技术，具有设备简单、操作方便而快速的特点。它是将固定相支持物均匀地铺在玻片上制成薄层板，将样品溶液点加在起点处，置于层析容器中用合适的溶剂展开而达到分离的目的。用此法分离时几乎不受温度的影响，可采用腐蚀性显色剂，而且可在高温下显色，特别适用于挥发性小或在较高温度下易发生反应的物质，同时也常用来跟踪有机反应或监测有机反应完

3、成的程度。薄层层析按分离机制不同可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析等，最常用的为吸附薄层层析，在此主要讨论。吸附层析中样品在薄层板上经过连续、反复的被吸附刑吸附及展开剂解吸附过程，由于不同的物质被吸附剂吸附的能力及被展开剂解吸附的能力不同，放在薄层上以不同速度移动而得以分离。通常用比移值(Rf)表示物质移动的相对距离：5Rf值计算示意图1．起点线；2.展开剂前沿a.色斑最高浓度中心至原点中心的距离b.展开剂前沿至原点中心的距离叶绿素：吡咯衍生物和镁的配合物，是植物进行光合作用必需的催化剂，易溶于石油醚等非极性溶剂中。物质的比移值随化合物的结构、吸附剂、

4、展开剂等不同而异，但在一定条件下每一种化合物的比移值都为一个特定的数值。故在相同条件下分别测定已知和未知化合物的比移值．再进行对照，即可对未知化合物鉴别。薄层层析的器材选择：（1）基板：玻璃、塑料、金属箔，常用玻璃板。（2）吸附剂：吸附剂要有合适的吸附力，并且必须与展开剂和被吸附物质均不起化学反应。可用作吸附剂的物质很多，常用的有硅胶和氧化铝，由于吸附性好，适用于各类化合物的分离，应用最广。选择吸附剂时主要根据样品的溶解度、酸碱性及极性。氧化铝一般是微碱性吸附剂，适用于碱性物质及中性物质的分离；而硅胶是微酸性吸附剂，适用于酸性物质及中性物质的分离。以下简单

5、介绍吸附剂的几个基本参数。种类：常用：氧化铝（强极性）、硅胶（中强极性）不常用：硅藻土、纤维素、糖类、活性碳符号：H——无任何添加剂；G——加有锻石膏（Gypsum，CaSO4·1/2H2O）粘合剂；F——加有荧光素（Fluorescein）CMC——加有羧甲基纤维素钠（Carboxymethylcellulose）例：硅胶GF254表示硅胶中既加有煅石膏粘合剂，也加有荧光素，可以在波长254nm的紫外光下激发出荧光粒度：目：1cm2内的筛孔数，数目越大，颗粒越小。薄层所用吸附剂颗粒较细，氧化铝为200目，硅胶为100~150目。μ：颗粒的平均直径，以微米

6、表示。例如：40μ的颗粒与100目相当。活性：吸附剂按其含水量的多少各分为五个等级：I级含水量最少，活性最高；V5级含水量最多，活性最低；但并不是活性越高分离效果越好，选用哪种活性级别的吸附剂，要用实验的方法来确定。酸碱性：市售氧化铝有酸性（用以分离酸性化合物）、中性、碱性（用以分离生物碱等碱性化合物），其蒸馏水洗出液的pH值分别为4、7.5、9—10；其中以中性氧化铝应用最广，可用来分离各种化合物，特别是那些对酸、碱敏感的化合物。硅胶没有酸碱性之分。（3）展开剂在样品组分-吸附剂-展开剂三个因素中。对一确定组分，样品的结构和性质可看作是一不变因素，吸附剂

7、和展开剂是可变因素。而吸附剂的种类有限，因此选择合适的展开剂就成为解决问题的关键。展开剂的选择有以下要求:（a）对待测组分有很好的溶解度。（b）能使待测组分与杂质分开，与基线分离。（c）使展开后的组分斑点圆而集中，不应有拖尾现象。（d）使待测组分的Rf值最好在0.4~0.5，如样品中待测组分较多，Rf值则可在0.25~0.75范圈内，组分间的Rf值最好相差0.1左右。由于薄层色谱法用途非常广泛，国内外均有现成的铺有吸附剂的薄层板出售。一般实验室中也可自己制备。(e)不与组分发生化学反应，或在某些吸附剂存在下发生聚合。(f)具有适中的沸点和较低的粘滞度。展开

8、剂的极性是指与样品组分相互作用时。展开剂分子与吸附剂分子的色散作用