mtt配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项

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1、MTT实验操作步骤1.收集对数生长期细胞制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5×104/ml。（MG63/DOXandSF-86细胞都是这个浓度）。2.细胞悬液吹打均匀后，用排枪接种到96孔板，每孔100ul(即5000个细胞)。3.种完细胞后6—24小时后，等其完全贴壁，将排枪调至130ul，将上清液培养基吸出（吸取过程中要动作要轻，沿孔壁至每孔的左下角，枪尖不要在底面滑动，防止损伤细胞）。4.用完全培养基将药物按梯度配制好，每孔加入含药培养基150ul，孵育72小时（每个药物做3个复孔）。5.72h后，将排枪调至180ul，将上清液培养基

2、吸出，每孔加入50ul0.5mg/ml的MTT溶液，孵箱内孵育4小时。（MTT溶液配制方法：MTT粉末先用PBS缓冲液配制成5mg/ml，超声溶解后过0.22ul微孔滤膜除菌，4℃保存，此为MTT母液，母液四度可保存一月，配制时注意不要配太多！！实验中MTT溶液为MTT母液10倍稀释与不含血清培养基，e.g.如果需要10mlMTT溶液，取1ml母液加9ml不含血清培养基）6.4h后，排枪调至80ul，将上清MTT溶液吸出（注意不要损失底面的紫色结晶），每孔加入150ulDMSO溶液，孵箱内孵育1小时，以便结晶完全溶解。7.读板器读板（读板前

3、注意观察紫色结晶是否完全溶解）8.读板设置为570nm跟650nm两波长读数，输出OD值为570nm处读数-650nm处读数。e.g.cellplate:　　　　　　　　　　　　DRUG1controlcontrol0.10.20.40.81.63.26.412.8ug/ml　controlcontrol　　　　　　　　　controlcontrol　　　　　　　　　DRUG2controlcontrol　　　　　　　　　controlcontrol　　　　　　　　　controlcontrol　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Re

4、sult:0.07720.24760.24440.23940.19910.17840.16170.13760.10280.09660.08420.07750.07440.31080.29420.26830.23870.22390.18910.17370.12890.10630.09660.07650.0760.31110.31850.28990.24720.21750.20480.16280.13670.11110.0940.07880.07240.31040.3190.27470.25130.22270.21440.16580.14390

5、.11780.09380.07860.07850.31520.30390.28320.26110.23030.1930.16780.15060.10820.07970.07540.07230.28830.3140.28640.25910.22830.20230.15650.1510.1230.09810.08080.07410.26440.29280.28480.27170.20650.18520.15660.14410.12040.08990.08340.0790.28460.26470.27430.22550.19530.17590.1

6、6440.14050.10830.08440.0832MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项-一、MTT是什么MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。（可参考Sigma，货号M5655，ThiazolylBlueTetrazoliumBromide）二、MTT法用来做什么简单地说：是一种检测细胞存活和生长的方法

7、。MTT主要有两个用途1．药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定；2．细胞增殖及细胞活性测定。三、为何MTT可以用来做上述工作检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。四、

8、实验所需材料1．MTT溶液的配制通常MTT配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。市面上一般MTT的包装为100mg,250mg或1g1.1对于100mg这样的小