蛋白含量(lowry法)测定标准操作规程

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1、细胞因子蛋白含量（Lowry法）测定标准操作规程依据：《中华人民共和国药典》2005年版第三部。范围：适用于细胞因子原液的检定。目的：检测细胞因子原液的蛋白质含量。原理：lowry法是在双缩脲反应的基础上发展起来的。是由试剂A和试剂B二部分组成。试剂A是碱性铜试剂；试剂B含有磷钨酸和磷钼酸。在碱性条件下，蛋白质与碱性铜试剂产生双缩脲反应，形成紫红色的蛋白质与铜的复合物，然后此复合物中的酪氨酸和色氨酸残基还原试剂B中的磷钼酸-磷钨酸，产生深兰色，为钼兰和钨兰的混合物，其呈色强度与蛋白质浓度呈正相关，可用比色法测定蛋白质浓度。内容：1材料1．1样品：经二

2、人核对好批号后测定。1．2试剂钨酸钠Na2WO4·2H2O化学纯钼酸钠Na2MOO4·2H2O分析纯磷酸H3PO4分析纯浓盐酸HCl分析纯硫酸锂Li2SO4分析纯酒石酸钾钠C4H4O6KNa·4H2O分析纯硫酸铜CuSO4分析纯氢氧化钠NaOH分析纯无水碳酸钠Na2CO3分析纯溴水Br2分析纯1．3标准品：由中国药品生物制品检定所提供。1．4注射用水：符合《中华人民共和国药典》2005年版要求。1．5其它材料：试管架、吸球、硫酸纸、药勺、记号笔、玻璃比色杯。1．6仪器、设备紫外分光光度仪,UV-265扭力天平，TN100B冰箱，BOD-170A1．7

3、器皿试管、量筒（250ml、100ml）、玻璃瓶（500ml、250ml）、棕色磨口瓶（50ml、500ml）、吸管（1ml、5ml、10ml），以上均由本室洗刷组处理干净。2方法2．1准备工作2．1．1工作环境：控制区确认场地清场合格，摘下“清场合格”标志牌,挂上“使用中”标志牌。2．1．2调试仪器设备2．1．2．1紫外分光光度仪，确认运行状态完好，已挂有“备用”标志。2．1．2．2扭力天平，确认运行状态完好，已挂有“备用”标志。2．1．2．3冰箱，确认运行状态完好，已挂有“备用”标志。2．1．3试剂配制2．1．3．1试剂A：用扭力天平准确称取20

4、克Na2CO3溶于500ml0.2mol/LNaOH溶液中，另将1克CuSO4·5H2O溶于100ml2%酒石酸钾钠溶液中，临用前将二种溶液按50：1的比例在250ml洁清的玻璃瓶中混合均匀，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期。放置30分钟，即为试剂A。2．1．3．2试剂B：在2升磨口回流蒸馏器中，向烧瓶中加入钨酸钠（Na2NO4·2H2O）100克，钼酸钠（NaMO4·2H2O）25克，蒸馏水700ml，85%磷酸50ml，浓盐酸100ml，充分混匀后接通回流凝管，沸腾后文火回流10小时，冷却后加硫酸锂150克，蒸馏水50m

5、l及数滴溴水，摇匀，取下回流冷凝管，开口继续沸腾15分钟，以驱走过量的溴，此时溶液为金黄色，冷却后用蒸馏水定容至1000ml放棕色瓶中4℃冰箱保存，回流整个过程应在通风橱中进行，使用时2倍稀释。二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4℃冰箱放置。2．1．3．30.2MNaOH：用扭力天平准确称取NaOH0.8克，加注射用水至100ml，配好后的液体放250ml洁净的玻璃瓶中，盖上胶栓，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，室温备用。2．1．3．42%酒石酸钾钠：用扭力天平准确称取酒石醋酸钾钠2克，加注射用水

6、至100ml，配好后的液体放入250ml洁净的玻璃瓶中，盖上胶栓，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，放4℃冰箱备用。2．2具体操作步骤2．2．1摘下设备上的“备用”标志，挂上“运行”标志，设备的详细操作参见设备标准操作规程。2．2．2取洁净干燥的试管若干，分成二组按下表进行操作。表1试管编号处理123456789101112标准溶液（ml）0.00.20.40.60.81.0DdH2O（ml）1.00.80.60.40.20蛋白质（mg/ml）试剂A（ml）5.05.05.05.05.05.0充分混匀，室温（20℃~25℃）

7、放置十分钟试剂B（ml）0.50.50.50.50.50.5迅速混匀，室温放置30分钟，以1、2管为空白，打开紫外分光光度仪，挂上“运行”牌，在波长650nm处比色测定。2．2．3标准曲线的绘制，将测得的两组平均OD值和对应蛋白含量值输入紫外分光光度仪中，建立回归方程，画出回归曲线，即为标准曲线。2．2．4待测样品蛋白质的测定，样品蛋白质浓度的测定过程同4.2.1项方法。表2样品批号管号OD650稀释倍数蛋白含量结果（平均值）2．2．5将所使用的仪器关闭，拔下电源。2．2．6场地摘下“使用中”的标志牌，挂上“待处理”标志牌。3结果的判定3．1判定标准

8、取二组测试样品的OD650平均值，输入回归方程所得的结果乘以稀释倍数，即为测试样品的实际蛋白质浓度。3．2判