细菌琥珀酸脱氢酶（sdh）活性比色法定量检测试剂盒产品说

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1、细菌琥珀酸脱氢酶（SDH）活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途细菌琥珀酸脱氢酶（SDH）活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用合成电子受体染料，通过反应系统测定染料还原后峰值的降低，即采用比色法测算样品中单位酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种细菌菌株裂解悬液和膜蛋白样品琥珀酸脱氢酶的特异性活性检测。用于衰老、能量代谢、蛋白组学、发酵分析等研究。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。技术背景琥珀酸脱氢酶（succinatedehydr

2、ogenase；SDH；EC1.3.99.1）是三羧酸循环（tricarboxylicacidcycle；TCA）或Krebs循环中与细胞线粒体膜相关的重要元素，位于线粒体内膜，参与细胞呼吸链。细菌琥珀酸脱氢酶，又称为SdhCDAB，为膜结合性蛋白，分为周边（peripheral）和跨膜（transmembrane）部分，其中周边亲水部分由SdhA和SdhB亚体组成：SdhA亚体含有黄素蛋白（flavoprotein），是琥珀酸的活性部位；SdhB含有铁硫蛋白（iron-sulfurprotein），进行电子传递；跨膜疏水部分由Sd

3、hC和SdhD亚体组成：SdhC含有亚铁血红素-B（Heme-B），SdhD含有泛醌（ubiquinone）结合部位（Q部位）。其作用在于参与三羧酸循环（TCAcycle）和呼吸链活动。琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸（succinate）的氧化反应，产生延胡索酸（furmarate），通过黄素腺嘌呤二核苷酸（FlavinAdenineDinucleotide；FAD）传递电子。基于琥珀酸脱氢酶的反应原理，使用人工电子受体染料二氯靛酚钠（2,6-Dichloroindophenolsodium；DCIP），接受来自还原型黄素腺嘌呤二核苷酸（R

4、educedflavinAdenineDinucleotide；FADH2）的电子，而被还原，在分光光度仪下，其吸光值（600nm波长）的变化，来测算琥珀酸脱氢酶的活性。其反应方式为：产品内容裂解液（ReagentA）毫升活性液（ReagentB）微升缓冲液（ReagentC）毫升反应液（ReagentD）毫升底物液（ReagentE）毫升阴性液（ReagentF）微升产品说明书1份保存方式保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；反应液（ReagentD）含有毒性物质，避免直接用手接触；底物液（ReagentE），避免光照；有效保证3月

5、3用户自备15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器1.5毫升离心管：用于样品操作和保存的容器超声仪：用于裂解细菌细胞（微型）台式离心机：用于样品操作恒温水槽或培养箱：用于反应物孵育比色皿：用于比色测定的容器分光光度仪：用于比色分析实验步骤实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；底物液（ReagentE）注意避光。然后进行下列操作。一、样品准备1．准备好10毫升待测的细菌放进37℃摇床孵育16小时，速度为220RPM2．直至OD600＝0.4至0.8，即1至2X107细胞/毫升3．置于冰槽里5分钟4．放进4℃台式

6、离心机离心5分钟，速度为1000g5．小心抽去上清液6．加入xx微升裂解液（ReagentA），充分混匀7．转移到预冷的1.5毫升离心管8．加入xx微升活性液（ReagentB）9．强力涡旋震荡15秒10．至于超声仪下超声处理：100功率，20秒超声一次，冰上间隙1分钟，重复3次11．放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为500g12．小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管13．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1）14．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续

7、后续操作二、测定准备1．准备好待测样品，置于冰槽里2．设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长600nm，间隔60秒，读数6次（共5分钟），并置零3．缓冲液（ReagentC）室温下均衡温度三、背景对照测定1．移取xx微升缓冲液（ReagentC）到新的比色皿2．加入xx微升反应液（ReagentD）3．加入xx微升底物液（ReagentE）4．放进30℃培养箱里静置3分钟31．加入xx微升阴性液（ReagentF）2．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）3．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：OD0分钟－OD5分钟三、样品活性测

8、定1．移取xx微升缓冲液（ReagentC）到新的比色皿2．加入xx微升反应液（ReagentD）3．加入xx微升底物液（ReagentE）4．放进30℃培养箱里静置3分钟5．加入100微升待测样品（注意：10微克总膜蛋白或100微克