β-葡萄糖苷酶的分离纯化

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1、本章以裂褶菌DS1液体发酵粗酶液为研究对象，对粗酶液中β-葡萄糖苷酶先后进行硫酸铵沉淀、DEAE-SepharoseFastFlow阴离子层析、Sephacry1S-200分子筛层析等方法对其进行分离纯化，并在此基础上对该酶的一般性质进行研究。4.1材料与方法4.1.1材料4.1.1.1菌种:裂褶菌（S.commune）DS1，由华中科技大学生命科学与技术学院资源与环境微生物所提供4.1.1.2培养基:斜面培养基(PDA培养基)：马铃薯(200g)，蔗糖(20g)，琼脂(30g)，水（1000mL）种子培养基(PDY培养基)：马铃薯(200g)，蔗

2、糖(20g)，水（1000mL）发酵培养基：纤维素(3.2g),蛋白胨(3.0g),KH2PO4(0.2g),Ca(NO3)2.4H2O(1.5g),MgSO4.7H2O(0.5g),水(100mL)4.1.1.3缓冲溶液0.2mol/LpH=8.10Tris-HCL缓冲溶液：称取6.055gTris溶于500mL双蒸水中；量取4.2mL盐酸溶液溶于500mL双蒸水中；将262mL盐酸溶液和500mL双蒸水（含Tris）混合即成0.2molpH=8.10Tris-HCl缓冲溶液。4.1.1.4试剂:对硝基酚-β-葡萄糖苷（pNPG）Sigma公司对

3、硝基酚（NPG）Sigma公司DEAE-SepharoseFastFlowAmersham公司Sephacry1S-200Amersham公司蛋白胨北京奥博星生物技术有限责任公司硫酸铵上海实验试剂有限公司过硫酸按Fluka公司考马斯亮蓝R-250，G-250北京鼎国生物技术发展中心丙烯酞胺、甲叉双丙烯酞胺中国医药(集团)上海化学试剂公司TEMEDSigma公司PMSFSigma公司SDSSigma公司Tris上海伯奥生物科技有限公司甘氨酸Sigma公司甲硫氨酸上海伯奥生物科技有限公司低分子量标准蛋白天根生化科技（北京）有限公司PEG-20000天津

4、市科密欧实验化学试剂开发中心快速银染试剂盒碧云天生物技术研究所芦丁（≥95％）国药集团化学试剂有限公司槐角苷（90％）实验室自制槐角提取物（10：1）西安天园生物技术有限公司4.1.1.4仪器TG-332A微量分析天平上海天平仪器厂低速大容量离心机上海精密仪器仪表有限公司电泳仪(DYY-Ш型)北京六一仪器厂UV2000紫外-可见光分光光度计尤尼柯(上海)仪器有限公司4.1.2方法4.1.2.1粗酶液的获得方法将菌种DS1接种到PDA斜面活化3d后，挑取一定大小的菌块接入PDY培养基中，培养3d制备一级液体种，再以10％的接种量接入PDY培养基中培养

5、3d制备二级液体种。按10%的接种量将二级种加入含有100mL发酵培养基中，于27℃，150r/min摇床上培养。每天取一瓶发酵液在4000r/min条件下离心10min后，取上清液在标准条件下用pNPG测定β-葡萄糖苷酶的活性。如此持续取三角瓶内的培养液直至培养的第10d为止，取β-葡萄糖苷酶的活性最高的培养液为粗酶液。4.1.2.3对硝基酚标准曲线的绘制见方法2.1.2.2。4.1.2.4β-葡萄糖苷酶酶活测定对硝基酚-β-葡萄糖苷（pNPG）法[54]测定β-葡萄糖苷酶酶活。4.1.2.5蛋白质含量的测定考马斯亮蓝G250法。将测试酶液稀释到

6、一定浓度，取0.5mL于试管中再加入2.5mL考马斯亮蓝G250试剂，摇匀，静置10min后，在595nm条件下进行蛋白质含量测定。以牛血清蛋白做标准曲线为Y=4.905X-0.0131，R2=0.9928(Y为吸光值，X蛋白质含量)。4.1.2.6硫酸铵分级沉淀、脱盐和浓缩1.确定盐析时饱和度范围（1）取粗酶液7份，每份15mL;（2）分别用饱和度为20％-80%相对饱和度的(NH4)2SO4于4℃盐析12h;（3）以不加硫酸铵的酶液为对照，于冰箱中于4℃盐析12h；（4）8500r/min于4℃离心20min;（5）分别收集各离心管中的上清液和

7、沉淀，并用pH5.0的乙酸-乙酸钠恢复至原体积，在A595与A410条件下分别测定其蛋白质含量和β-葡萄糖苷酶活力。2.最佳pH条件下盐析（1）在100ml粗酶液中缓慢加入硫酸铵至X1%饱和度；（2）4℃静置12h;（3）4℃，8500r/min条件下离心20min，取上清液，测量上清液体积；（4）在上清液中继续缓慢加硫酸铵至X2%饱和度；（5）4℃静置12h;（6）4℃,8500r/min条件下离心20min，取上清液，沉淀溶于最佳pH值的乙酸-乙酸钠中。并在相同的缓冲溶液中透析过夜，直至检测不出SO42+为止,4500r/min离心15min，

8、取上清。4.1.2.7DEAE-SepharoseF.F.阴离子交换柱层析将收集的上清液施于经Tris-HCL缓冲液(pH