口蹄疫病毒非结构蛋白3d单克隆抗体的制备及鉴定

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1、口蹄疫病毒非结构蛋白3D单克隆抗体的制备及鉴定作者：田美娜,李永亮卢曾军,付元芳,袁明,刘湘涛,刘在新【摘要】目的:制备并鉴定口蹄疫病毒（FMDV）非结构蛋白3D的单克隆抗体(mAb)。方法:以纯化的原核表达3D蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,杂交瘤细胞经间接ELISA法筛选,有限稀释法克隆,直至所克隆的细胞能够100％的分泌抗体,用Westernblot以及间接免疫荧光法对mAbs的特异性等进行鉴定。结果:免疫的BALB/c小鼠经过多次融合筛选,共获得5株抗pET28a3D

2、的mAb,其亚类鉴定3株为IgG1,2株为IgG2b,初步判定所得5株mAb识别2个不同表位。Westernblot显示这些mAbs与重组3D蛋白和FMDVO/China99感染的BHK21细胞中的3D抗原均特异性结合,免疫荧光结果显示这5株mAb能够特异结合FMDV感染细胞中的3D蛋白。结论:成功获得了能识别自然3D蛋白的特异性mAb,为进一步研究3D蛋白的结构和功能以及诊断方法奠定基础。【关键词】口蹄疫病毒;非结构蛋白3D;单克隆抗体;原核表达口蹄疫(footandmouthdisease,F

3、MD)是由口蹄疫病毒(footandmouthdiseasevirus,FMDV)引起的偶蹄动物的急性、热性、高度接触性传染病,世界动物卫生组织将其列为A类传染病之首,10该病一经暴发就会给畜牧业生产造成巨大的经济损失,严重影响了政治、经济的稳定发展,世界各国都高度重视对该病的防控,完善的诊断和检测技术体系是控制和消灭该病的关键。检测非结构蛋白抗体的ELISA方法不受血清型限制,因此在疫情普查、筛查感染动物、防制效果评价和恢复无FMD状态等方面具有重要的应用。FMDV的3D蛋白是具有469个氨基酸的

4、病毒RNA依赖的RNA聚合酶,又称病毒感染相关性抗原,没有型特异性,在FMDV所有非结构蛋白中,3D抗原性最好,检测3D的ELISA方法具有与检测结构蛋白的ELISA方法相当的特异性、准确性和敏感性,是评价动物是否接触过抗原的重要指标,在检测中具有重要的应用前景［1-4］。本实验利用原核表达的3D蛋白制备单克隆抗体（mAb）,为建立更为完善的ELISA诊断方法和检测技术以及进一步研究3D蛋白的结构和功能提供基础资料。1材料和方法1.1材料O/China99口蹄疫病毒、BHK21细胞株、牛抗FMDV高免

5、血清均为本实验室保存,Sp2/0骨髓瘤细胞为兰州市市肿瘤医院惠赠,3D蛋白原核表达重组菌由刘湘涛研究员惠赠,SPF级雌性3～4周龄BALB/c小鼠购自兰州生物所,福氏佐剂、10聚乙二醇(PEG)1450溶液、HAT、HT以及四甲基联苯胺(TMB)、HRP标记羊抗小鼠总IgG、mAb亚型鉴定试剂盒均为Sigma产品;RPMI1640培养基、新生牛血为Hyclone公司产品,FITC标记羊抗小鼠IgG购于KPL公司,HITraprProteinGFF,1m蛋白纯化柱为Amersham公司产品,NiNTAP

6、urificationSystem购于Invitrogen公司,其他试剂均为进口分装或国产分析纯。1.2方法1.2.1重组pET28a3D蛋白的表达、纯化及活性鉴定按文献［5］所述方法表达3D蛋白,将可溶性表达的3D蛋白按NiNTAPurificationSystem操作说明书进行纯化,用SDSPAGE电泳鉴定纯化产物的纯度,用Westernblot鉴定其特异性。Westernblot方法参照文献［6］进行:以牛抗FMDV高免血清为一抗,Sigma公司辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG为二抗,DAB

7、染色。1.2.23DmAb的制备（1）小鼠免疫:取纯化的抗原按100μg/只加等体积弗氏完全佐剂背部皮下注射,2周后用弗氏不完全佐剂第2次免疫,剂量、注射部位同前,2周后以不加佐剂的等量抗原于后肢内侧皮下注射,1周后采尾静脉血测抗体效价,取抗体水平较高的小鼠于1周后尾静脉加强免疫1次,在此之后第3天融合。（2）阳性杂交瘤细胞株的建立:10采用常规的PEG融合的方法取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合。用纯化的重组pET28a3D蛋白包被聚苯乙烯板,取融合后第10～15天的细胞培养上清进行间接ELI

8、SA检测,选择检测结果为强阳性的克隆扩大培养,同时用有限稀释法至少连续克隆3～5次,直至所克隆的细胞能够100%分泌抗体。将能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞扩增培养后,冻存于液氮中。1.2.3腹水的制备将0.5mL降植烷注射到10周龄左右的健康雌性BALB/c小鼠的腹腔,1周后注入106个杂交瘤细胞于小鼠腹腔,7～10d后,当小鼠腹部极度膨胀时抽取腹水,4℃,12000g离心10min后,0.45μm滤器过滤后用G蛋白柱纯化,加500mL/L甘油