stat3survivin途径介导槲皮素调控胃癌细胞增殖和凋亡

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1、STAT3SURVIVIN途径介导槲皮素调控胃癌细胞增殖和凋亡【摘要】目的:观察STAT3SURVIVIN途径在槲皮素调控胃癌细胞SGC7901增殖和凋亡中的作用.方法:不同浓度的槲皮素及阳性对照组(AG49040μmol/L)作用细胞后,MTT法检测细胞毒作用;流式细胞术检测细胞凋亡;RealtimeRTPCR,WesternBlotting检测stat3，survivin基因mRNA及蛋白的表达.结果:随作用时间延长和浓度增高，槲皮素对SGC7901细胞增殖的抑制作用增强.48h槲皮素40μmol/L组与阳性对照组凋亡率相近.Stat3，survivinmRNA之

2、间呈直线相关关系(r=0.697，P=0.002)，且pstat3和survivin蛋白也呈直线相关关系(r=0.748，P=0.003).结论:槲皮素可能通过调控STAT3SURVIVIN途径抑制胃癌SGC7901细胞增殖并诱导凋亡.【关键词】stat3基因survivin基因槲皮素胃肿瘤细胞增殖细胞凋亡信号转导通路　　0引言　　槲皮素(quercetin,Que,3,3′,4′,5′,72五羟基黄酮)又称槲皮酮,为中药槲树皮的主要提取成分,具有广泛的药理活性，如抗炎、抗肿瘤等.Stat3，survivin是继bcl2之后相继发现的两个重要的凋亡抑制基因.9大量体内

3、外研究表明抑制这两种基因的表达或功能可以抑制肿瘤细胞生长,促进凋亡［1-2］.黄酮类抗肿瘤药槲皮素是否通过抑制STAT3SURVIVIN途径促使肿瘤细胞调亡，目前尚属未知.我们施用槲皮素于胃癌SGC7901细胞,观察STAT3SURVIVIN途径在槲皮素调控胃癌细胞增殖和凋亡中的作用.　　1材料和方法　　1.1材料人中分化胃癌细胞株SGC7901,由兰州大学分子生物学教研室提供;干粉型RPMI1640,槲皮素,DMSO,AG490购自Sigma公司;胎牛血清购自杭州四季青公司;MTT购自Inventrogen公司;总RNA柱式提取试剂盒购自BBI公司;RealTime

4、PCR试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司.Stat3上游引物:5′CCAGTCAGTGACCAGGCAGAAG3′,下游引物:5′GCACGTACTCCATCGCTGACA3′,扩增产物114bp；survivin上游引物:5′AGGTCATCTCGGCTGTTCCTG3′,下游引物:5′TCATCCTCACTGCGGCTGTC3′,扩增产物127bp;内参照GAPDH上游引物:5′GTGCTTTGACAAATCCCATCTGA3′,下游引物:5′GTTACTGTCCCGGATCTTGTCCA3′,扩增产物138bp,均由宝生物工程（大连）有限公司

5、合成.兔抗人stat3多克隆抗体购自CellSignal公司;兔抗人survivin多克隆抗体购自SantaCruz公司.　　1.2方法9　　1.2.1细胞培养及MTT法检测细胞毒作用SGC7901细胞于含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养基中培养,37℃,50mL/LCO2孵箱中贴壁生长,2.5g/L胰酶消化传代.实验分为空白对照组,阴性对照组（0.5mL/LDMSO），阳性对照组（AG49040μmol/L），槲皮素4个浓度组（20,40，80，160μmol/L）.取同一批次对数生长期细胞制成单细胞悬液,5×103/孔接种于96孔板,每组设4个复孔.24h

6、细胞贴壁后,弃培养液,加200μL/孔无血清培养基同步化24h,再次吸弃培养液,加无血清培养基180μL/孔及各组药物,使终体积为200μL/孔,终浓度为所需值.分别于加药后24,48,72h测吸光度值A(λ=490nm).抑制率计算公式：细胞抑制率(%)=(1-A处理组/A对照组)×100%.计算IC50值,选择3个浓度进行后续实验.　　1.2.2流式细胞仪检测细胞凋亡实验分为阴性对照组、阳性对照组、槲皮素（40μmol/L）组.细胞以5×105/mL的浓度接种于50mL培养瓶，每组3瓶.处理步骤同上.加药后48h胰酶消化，收集细胞,离心（800r/min，5min）,弃

7、上清,加PBS液至总体积为1.5mL/管,上流式细胞仪（双染法）检测细胞凋亡.　　1.2.3RealTimeRTPCR检测stat3和survivin基因mRNA的表达实验分为阴性对照组、阳性对照组、槲皮素(20,40,80μmol/L)组.细胞处理同上.收集48h细胞，用EZSpinColumn提取细胞总RNA,RealTimeRTPCR反应参照试剂说明书进行.9　　1.2.4WesternBlot检测pstat3，survivin蛋白的表达实验分为阳性对照组、槲皮素（20,40,80μmol/L）组.细胞