免疫磁珠分离法分选提纯骨髓造血干细胞cd117

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1、免疫磁珠分离法分选提纯骨髓造血干细胞CD117【摘要】目的：探讨用免疫磁珠分离法（magneticactivatedcellsorting,MACS）从小鼠股骨、胫骨分离纯化骨髓造血干细胞CD117的方法。方法：收集小鼠骨髓细胞,台盼蓝染色观察其活力，用免疫磁珠分离法分选CD117细胞,流式细胞仪检测荧光标记CD117表达阳性率。结果；未分选前CD117细胞纯度为(41.56±18.77)%，MACS分选CD117细胞纯度(88.68±4.74)%，纯化前后有明显差异（P<0.05）。结论：MACS阳性选择法分选系统能有效分选骨髓造血干细胞CD117。【关键词】造血干细胞CD117

2、+细胞免疫磁珠分离法小鼠近交BALBC造血干细胞（HSCs）研究面临的首要问题是获得大量纯化的造血干细胞,并去除杂质细胞对实验的干扰[1，2]，近年在纯化技术方面的研究不多，尤其是对小鼠的研究较少。CKit或干细胞因子受体SCFR（CD117）是小鼠HSCs的主要标志[3]，2006年采用免疫磁珠分离法(MACS)分选骨髓造血干细胞亚群CD117，并用流式细胞仪进行计数，希望为造血干细胞的纯化和大量制备提供实验方法和理论支持。1材料和方法91.1实验动物BALB/C小鼠,(20±1)g,雌雄随机,10只/组，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供。1.2试剂和仪器BSA购自杭州四季青生

3、物工程材料研究所,荧光标记小鼠抗体CD117PE磁珠试剂盒、抗生物素磁珠、MiniMACS分离器及MS分离柱，均购自MiltenyiBiotec公司,流式细胞仪(FACSCalibur)购自BD公司。1.3实验方法1.3.1小鼠骨髓细胞收集颈椎脱臼处死小鼠，取小鼠股骨、胫骨，放在盛有缓冲液（含2mmol/LEDTA，0.5%BSA的PBS）的平皿中，去除骨上的肌肉组织及骨膜，切除骨的两末端，用1ml注射器（带4号针头）插入股骨膝盖端、胫骨骨端，用缓冲液反复冲洗骨腔，直至骨发白，所得细胞过200目滤网，1500r/min离心10min，小心去除上清液，加入59ml缓冲液混匀，进行细胞计数

4、。1.3.2MACs分离CD117细胞1.3.2.1小鼠系别细胞去除用缓冲液按40μl/107个细胞重悬小鼠骨髓细胞。加入生物素化抗体混合物10μl/107个细胞，混匀，4～8℃孵育10min。加入缓冲液30μl/107个细胞，20μl抗生物素微珠，混匀，4～8℃孵育15min。加入5ml缓冲液洗涤细胞，1500r/min离心10min，完全去除上清液。1.3.2.2磁性标记和分选CD117细胞将分选后得到的细胞用缓冲液按80μl/107个细胞重悬。加入CD117微珠20μl/107个细胞，混匀，4～8℃孵育15min，缓冲液1ml/107个细胞洗涤细胞，1500r/min离心10min

5、，完全去除上清，用500μl缓冲液重悬，所得细胞悬液加入MS分选柱中，收集先行流出的未标记细胞组分，并用1500μl缓冲液冲洗MS柱，此为CD117阴性细胞。将分选柱移出磁场，1ml缓冲液快速将分选柱上滞留的细胞洗脱下来，这些细胞是磁性标记的CD117阳性细胞。1.3.3流式细胞仪分析9将分选前的标本、对照管、分选后阴性管标本及分选后阳性管标本进行流式细胞仪分析。在上述富集细胞管中加入100μl缓冲液，10μlCD117抗体混匀，4℃黑暗中孵育10min，加入1000μl缓冲液1500r/min离心10min，完全去除上清液，加入500μl缓冲液混匀，送流式细胞分析,设阴性对照和空白对照

6、。1.3.4细胞染色计数0.4%台盼蓝按9∶1（V∶V，细胞悬液量：染色液量）对细胞进行染色。镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。细胞活力的测定:0.4%台盼蓝染色1min，计算活细胞率，活细胞率（%）=活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%。1.4统计学处理用SPSS11.1进行统计学数据分析，用配对样品t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1骨髓细胞的收集从1只小鼠股骨、胫骨可收集5.25×107个骨髓细胞，细胞活力90%，2只小鼠股骨、胫骨可收集8.48×107个骨髓细胞，细胞活力92%。92.2MACS分选造血干细胞1只小鼠股骨、胫骨可收集（

7、1.1±0.3）×105个造血干细胞。2.3流式细胞仪分析结果免疫磁珠纯化前CD117阳性细胞纯度为（41.56±18.77)%，纯化后CD117阳性细胞纯度为(88.68±4.74)%，纯化前后有明显差异（P<0.05）。经免疫磁珠纯化后、未经免疫磁珠纯化小鼠骨髓干细胞收集物，流式细胞仪测定CD117+阳性细胞的纯度见图1。　　3讨论骨髓内主要有两类干细胞群体,即造血干细胞(hematopoieticstemcells,HS