糖基化终产物对人脐静脉内皮细胞血管内皮生长因子mrna及蛋白表达的影响

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1、糖基化终产物对人脐静脉内皮细胞血管内皮生长因子mRNA及蛋白表达的影响【摘要】目的研究糖基化终产物(AGEs)对人脐静脉内皮细胞血管内皮生长因子(VEGF)mRNA及蛋白表达的影响，探讨AGEs在糖尿病动脉粥样硬化中的作用。方法将人脐静脉内皮细胞株ECV304用BSA及不同浓度的AGEs孵育24h及400mg/L的AGEs孵育0、12、24及36h，采用原位杂交及Westernblot方法检测VEGFmRNA及蛋白的表达。结果人脐静脉内皮细胞在100、200及400mg/LAGEs孵育24h后，VEGFmRNA及蛋白

2、表达均显著高于BSA对照组(P＜005)，在用400mg/LAGEs分别孵育12、24及36h后，各组内皮细胞VEGFmRNA及蛋白表达量也明显高于0h对照组(P＜005)。结论AGEs可增加人脐静脉内皮细胞VEGFmRNA及蛋白的表达，且与浓度和时间呈正相关。【关键词】糖基化终产物；人脐静脉内皮细胞；血管内皮生长因子；动脉粥样硬化大血管病变是2型糖尿病患者主要致残、致死的原因，其病理基础是动脉粥样硬化(AS)形成〔1〕，其确切机制不详。终末糖基化终产物(AGEs)是生物胺与还原糖在无酶条件下经复杂的重排、脱水及

3、缩合而成的不可逆的共价产物，研究证实糖尿病动物及患者体内有大量AGEs堆积。血管内皮生长因子(VEGF)是目前已知最强、最主要的诱导血管发生的生长因子，在AS的形成中起着重要的作用。它除了通过诱导内膜微血管形成而参与AS损伤以外，还可通过改变内皮通透性及其表面黏附分子的表达、诱导单核细胞趋化迁移等多种途经促进AS的形成〔2〕。本研究以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)为实验对象，采用原位杂交和Westernblot从AGEs对人脐静脉内皮细胞VEGFmRNA及蛋白表达的影响角度探讨AGEs在糖尿病AS中的作用。1材料与

4、方法11材料人脐静脉内皮细胞株ECV304(中科院上海细胞所)，1640培养基(GIBCO)，新生牛血清(郑州)，VEGF原位杂交试剂盒、兔抗VEGF抗体、DAB显色试剂盒(武汉博士德)，DAPDH(上海康成)，胰蛋白酶、D葡萄糖、牛血清白蛋白(BSA)(华美)。12AGEs的制备参照Horiuchi等〔3〕的方法将16gBSA与30gD葡萄糖溶于10ml05mol/L(pH74)PBS中，022μm微孔膜滤过除菌，37℃孵育90d，然后用05mol/L(pH74)PBS透析去除未结合的葡

5、萄糖。对照组中BSA中不含葡萄糖，余条件一致。本实验制备的AGEBSA经荧光分光光度计鉴定，其AGEs含量为872kU/g，对照组为21kU/g。13细胞培养及分组人脐静脉内皮细胞ECV304用RPMI1640+10%56℃灭活的新生牛血清，于37℃、5%CO2的条件下培养，隔天换液。将传代的ECV304内皮细胞调整细胞数在1×108L-1，每孔2ml接种于预先放置有灭菌盖玻片的6孔培养板中培养，每隔1d换液1次，细胞生长至融合状态后，无血清培养液饥饿24h，然后随机分为实验组和对照组。实验组又分

6、为两组：不同浓度组分别于含100、200及400mg/LAGEs的无血清培养液培养24h，不同孵育时间组于400mg/LAGEs的无血清培养液分别培养0、12、24及36h；对照组加含未修饰BSA的无血清培养液培养。所有实验均重复3次。14原位杂交杂交所用探针序列为5′GCTCTACCTCCACCATGCCAAGTGGTCCCA3′。按照VEGF原位杂交检测试剂盒使用说明书进行操作。将培养于盖玻片的各组内皮细胞用01mol/LPBS(pH74)洗2min×3次，用4%多聚

7、甲醛01MPBS(pH72～74)，含有1/1000DEPC，室温固定20min。新鲜配制05%H2O2/甲醇室温处理30min。3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶室温消化60s。37℃预杂交液4h，37℃杂交过夜。以2×SSC、05×SSC及02×SSC洗片，封闭液37℃封闭30min，生物素化过氧化物酶37℃孵育20min，SABC37℃孵育20min，DAB显色，苏木素复染，酒精脱水，二甲苯透明，封片。镜下观察，并采用Metamorph/DP10型细胞图像分析仪进行VE

8、GFmRNA的半定量分析，阴性对照用预杂交液替代探针工作液。15Westernblot于不同时间点收集细胞，加细胞裂解液，4℃裂解1h，4℃15000r/min离心30min，提取上清并测定蛋白。每个样品取50μg用15%SDSPAGE电泳转移至硝酸纤维素膜上。用5%脱脂奶粉封闭1h后，分别加入兔抗VEGF及鼠抗GAPDH一抗(稀释浓