制备和转化感受态大肠杆菌的inoue方法总结：

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1、Inoue法制备感受态大肠杆菌总结1．培养基的准备SOB培养基：100ml胰化蛋白胨2g酵母提取物0.5gNaCl0.05g250mMKCl1ml高压灭菌使用前加2mol/LMgCl20.5mlSOB琼脂板（含20mmol/LMgSO4和20mmol/L氨苄）100ml胰化蛋白胨2g酵母提取物0.5gNaCl0.05g琼脂1.5g250mMKCl1ml高压灭菌50℃温浴再加2mol/LMgSO41ml2mol/LMgCl20.5ml20mg/ml氨苄100ul混均倒平板（90mm2）SOC培养液50ml胰化蛋白胨1g酵母提取物0.25gNaCl0

2、.025g250mMKCl0.5ml2mol/LMgCl20.25ml1mol/L葡萄糖(0.22um过滤除菌)1ml1．INOUE转化缓冲液的准备：(250ml)MnCL2.4H2O2.72gCaCL2.2H2O0.55g定容到250mlKCL4.6625gPIPES(0.5mol/L,PH6.7)5ml0.45μm孔径滤膜过滤，分50ml每份—20℃保存2．挑取一个经37℃培养19h平皿上的单菌落（2~3mm直径），接种至250ml锥形瓶中的25mlSOB培养液中，37℃摇床（250~300r/min）培养6~8小时。（此时培养物OD600约

3、0。680）3．从上述的25ml的初始培养物接4ml大肠杆菌于盛有100mlSOB的500ml锥形瓶中，于18~22℃中速摇床过夜。次日取出达到OD值0.55时的培养液置于冰浴中10min。4．平均分装到两个50ml的贝克曼离心管于4℃以2500g在贝克曼离心机上离心10min收集菌体。5．倒去培养液，将离心管倒扣在吸水纸上2min以吸干剩余液体，用真空吸引器将贴附在管壁的培养基吸干。6．加32ml冰预冷的Inoue转化缓冲液轻轻旋转重悬细菌(没有用枪吹吸和振荡重悬)7．于4℃2500g离心10min收集菌体。10．倒去上层培养液，将离心管倒扣在

4、吸水纸上2min以吸干剩余液体，用一真空吸引器将附在管壁上的培养基吸干。冻存感受态细胞11．用8ml预冷的Inoue转化缓冲液轻轻重悬沉淀(此时两管混合于一管)。12．向剩余的细胞中加0.6mlDMSO，混匀冰浴10min.13．迅速将悬液分装到冷却的无菌1.5ml离心管中（每管200ul），没入液氮中快速冰冻感受态细胞。贮存于-70℃备用。转化15．要转化的PET加入装有感受态细胞（加DMSO保存于-70℃的感受态细胞）的管中，轻轻旋转几次混匀内容物。设一对照管：只有感受态细胞。冰浴30min[保存于-70℃的感受态细胞从冰箱拿出后用手心溶解后

5、立即在冰浴上冰浴10min,然后再加INSERTDNA.]16．将管放入预加温到42℃的水浴中，恰恰放置90s，不要摇动。17．快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1~2min。18．每管加800μl在37℃培养箱中温浴到37℃的SOC培养基，然后将管转移到37℃摇床上，温育45min（中速温和摇培），使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗标记基因。19．将200μl体积的已转化的感受态细胞转移到含抗生素和20mmol/L,MgSO4SOB培养基上。于37℃培养箱正放到液体被吸收。20．倒置平皿12~16h后可出现菌落。转化PET标准质粒的结果如下图:图

6、A转化10μl浓度为50ng/μl的PET标准质粒图B转化2μl浓度为50ng/μl的PET标准质粒图C空白对照分析：（仅与本人每次成功的经验为准，供参考）1、本实验所用的菌株是XL1—BLEU，注意不同种的大肠杆菌的各种参数不同。2、培养基需新鲜配置，液体培养基的瓶子要专用，每次使用后洗净凉干后，锡铂纸封口，使用前只用清水洗后蒸馏水荡几遍，最后用超纯水润洗两遍。注意专用器皿都不用任何清洁剂，第一次使用时可以用稀的洗液浸泡。3、培养初始培养物的培养基可以用SOB或LB，其它步骤中所用各培养基均用SOB（MgCl2需在使前加）。4、大体积培养菌时如

7、温度固定在18~22℃，有如下细菌OD600的增长经验数值,多次记录时发现增长的情况相近，以一次记录为例希望能为以后制作时带来一点方便：时间OD6006：400.1007：400.1348：400.1659：400.19510：200.21811：240.25812：190.30313：000.32713：500.38614：500.43315：450.48316：180.52016：400.54516：500.5535、实验中有两次重悬沉淀步骤中要注意，勿用枪头吹吸的方法，只需在加入缓冲液以后轻轻悬转离心管就行了（轻重的标准是重悬时不会使里面的

8、液滴飞溅）。6、感受态细胞有液氮速冻后于-70℃可以长期保存（半年内感受性不会下降，以后将再继续延长观察期）。7、转化实验中最关键的是热