肺泡巨噬细胞的制备及rna提取

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1、PAM(肺泡巨噬细胞)的制备一、准备工作1、高压灭菌好的1×PBS两瓶（1000ml/瓶）、小托盘1个、500ml烧杯2个、大剪刀1把、镊子2把和50ml离心管若干。另需准备好解剖小猪用的手术刀片、棉线等。2、细胞培养液的配备生长液：10%胎牛血清+DMEM培养基+双抗+两性霉素二、制备细胞1、将小猪腋下放血致死2、从颈部剖开腹腔，避免伤到气管和肺脏3、用棉线结扎气管上部，然后剪断气管，将气管和肺脏完整取出来，放到准备好的大烧杯中4、转移到细胞培养室，用PBS冲洗干净肺脏表面，弃除杂物5、在操作工作台上用灭菌好的剪刀

2、剪断结扎了的气管。（以下步骤需无菌操作）6、吸取PBS灌进肺内，充盈后，用手轻轻捏揉肺叶数次后，把肺内液体倒出到蓝盖瓶中。7、重复灌洗2次8、将所收集的液体分装到50ml离心管中，4℃2000g、10min离心9、视情况可以将沉淀细胞再用PBS或培养基清洗离心1次10、在细胞沉淀中，加入2mlTrizol试剂，用移液器充分吹打、混匀，直到形成清亮不粘稠的液体（表明细胞被充分溶解，基因组DNA被充分打断）。11、后续可按Trizol试剂的标准操作抽提总RNA。也可以把此Trizol试剂保存在冰箱中保存。RNA抽提第二阶

3、段：分离阶段6．加入0.2ml氯仿,剧烈混匀20s,室温放置10min。7．10000rpm/min,4℃离心15min。第三阶段：RNA的沉淀8．吸取上清于5ml离心管中,加入0.5mL异丙醇（预冷）颠倒混匀5次,室温放置10min。(注意：在吸取上清时，切不可将上清与酚交界处的蛋白及下面的酚吸起，造成RNA的污染)9．10000rpm/min,4℃离心10min。（RNA沉淀在离心后形成胶质片状沉淀附着于试管壁）第四阶段：RNA的漂洗10．去上清,沉淀用1ml75%乙醇漂洗，振荡，7000rpm/min,4℃离心

4、10min，倒净乙醇。11．RNA沉淀加入0.5ml无水乙醇漂洗，振荡，7000rpm/min,4℃离心5min，倒净无水乙醇。（缩短RNA沉淀晾干的时间，避免RNA在空气中暴露时间过长而增加外源性Rnase对RNA的降解）第五阶段：RNA的再溶解12．在超净工作台上平放离心管,待离心管管壁无明显液滴时加入50μlDEPC处理的灭菌双蒸水，在55-600C温育10min，溶解RNA沉淀。13．将溶解充分的RNA溶液转移到1.5ml离心管中，做好标签，放入-800C的冰箱中保存备用。总RNA检测及浓度测定总RNA的完整

5、性可通过普通琼脂糖凝胶电泳检测，过程如下：1.制备1.2％琼脂糖凝胶：将1.2g琼脂糖溶于1×TAE中，稍加冷却，加入少许EB，混合均匀后，灌制凝胶，待凝胶凝固好后，即可使用。2.点样：取2μL总RNA与2μLGelLoadingBuffer及6μLDEPC水混合后点于点样孔中，15V/cm，电泳20min。3.拍照：电泳结束后，用紫外透射仪观察，并用凝胶成像系统成像。4.用紫外分光光度计测量总RNA样品浓度，每个3次，取平均值。5.根据所测浓度，用DEPC水稀释每个RNA样品浓度至1μg/μL，其余样品保存在超低温

6、冰箱备用。总RNA反转录根据TIANGENTIANScriptRTKitcDNA第一链合成试剂盒，其操作步骤如下：1)在冰浴的无核酸酶的离心管中加入如下反应混合物：1－5μg总RNA，2μLoligo(dT)15,2μLdNTP(2.5mMeach),补RNase-freeddH2O定容至13.5μL。2)70℃加热5分钟后迅速在冰上冷却2分钟，简短离心收集反应液后加入一下各组分：4μL5×First-StrandBuffer,1μL0.1MDTT,0.5μLRNasin.3)加1μL（200U）TIANScript

7、M-MLV,轻轻用移液器混匀。4）42℃温浴50分钟。5）95℃加热5分钟终止反应，以看家基因（GAPDH）引物扩增，验证反转录是否成功，将反转录产物置于-20℃保存备用。