小反刍兽疫免疫胶体金试纸卡检测方法.doc

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1、ICS点击此处添加ICS号点击此处添加中国标准文献分类号SN中华人民共和国出入境检验检行业标准XX/TXXXXX—XXXX小反刍兽疫免疫胶体金试纸卡检测方法Colloidalgoldimmunochromatographicassayfordetectionofpestedespetitsruminants点击此处添加与国际标准一致性程度的标识XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布XX/TXXXXX—XXXX前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准附录A、B为规范性附录，附录C、D为资料性

2、附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国西藏出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人：杨俊兴、刘忠清、赤列加措、文艺、孙洁、刘建利、唐金明、花群义。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。8XX/TXXXXX—XXXX小反刍兽疫免疫胶体金试纸卡检测方法1　范围本标准规定了进出口动物小反刍兽疫免疫胶体金试纸卡检测方法的检疫技术规范。包括样品的采集和处理、免疫胶体金试纸卡的组装、样品检测、结果判定等方法和技术要求。本标准适用于进出口动物小反刍兽疫血清抗体快速检测和现场检疫。2　规范性引用文件下列文

3、件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18088出入境动物检疫采样GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T2123-2008出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范3　缩略语3.1BSA：牛血清白蛋白3.2ICS:免疫层析试纸3.3PBS：磷酸缓冲液3.4PPR：小反刍兽疫3.5PPRV：小反刍兽疫病毒3.6SPG：链球菌G蛋白4　主要试剂和材料除特别说明外，本标准所用试剂均为分析纯。试验用水为符合GB/T6682规定的三级水

4、。4.11%氯金酸溶液（AuCl3·HCl·3H2O）。4.21%柠檬酸钠溶液。4.3PPRVN蛋白：为基因工程表达蛋白抗原（氨基酸序列见附录D）。4.4链球菌G蛋白(SPG）。8XX/TXXXXX—XXXX4.51%碳酸钾溶液（K2CO3）。4.6抗SPG多克隆抗体。4.7牛血清白蛋白（FragmentV）。4.8硝酸纤维素膜。4.9玻璃纤维棉纸。4.10PPRV阳性血清。4.11PPRV阴性血清。1　主要设备5.1恒温箱：37℃±1℃。5.2电子天平：精确值0.0001g。5.3台式冷冻离心机：最大离心力15000×g。5.4PH计。5.5试纸喷膜仪。5.

5、6试纸条切割机：可连续切割出2~5mm宽试纸。2　检测原理将胶体金标记的SPG体固定于金标垫，检测线为纯化的PPRVN蛋白，对照线为兔抗SPG。检测时，阳性样品中的抗PPRV抗体与胶体金标记SPG特异性地结合，在NC膜上移动时，被检测线上的PPRVN蛋白捕获，胶体金颗粒聚集于此，形成红色的条带，即检测线。相反，阴性样品中不含抗PPRV抗体，在检测线处不形成红色条带。对照线试剂兔抗SPG与胶体金标记SPG结合，捕获金标复合物，形成对照线。3　免疫胶体金试纸卡的组装7.1金标SPG及金标垫的制备首先用1%碳酸钠溶液调胶体金溶液的pH值为6.5，向50mL胶体金溶液

6、中缓慢地加入适量SPG溶液，室温搅拌30min，缓慢加入10%BSA至其终浓度为1%（w/v），继续搅拌30min。4℃4,000×g离心10min，将上清转移至另一离心管中，4℃12,000×g离心30min，小心弃去上清。用5mL（即1/10原体积）PBS（pH7.0）重悬沉淀。加入1%（w/v）的叠氮钠（NaN38XX/TXXXXX—XXXX）溶液至终浓度为0.02%，用试纸喷膜仪将胶体金溶液喷于300×5mm玻璃纤维棉上，速度为50μL/cm，并于4℃真空抽干，于4℃干燥保存备用。7.2检测线和对照线的制备用纯化的浓度为2mg/mL的PPRVN蛋白和兔

7、抗SPGIgG分别作为检测线和对照线试剂。用试纸喷膜仪将两种试剂分别点在硝酸纤维膜上，点样速度为0.75μL/cm。37℃干燥2h，4℃密封保存备。7.3试纸卡的组装按附录B图1所示，将背衬、样品垫、吸水垫、硝酸纤维膜、金标垫粘在一起，并试纸条切割机将其切成3.5mm宽的试纸条，将试纸条放入试纸卡中。4℃干燥保存备用。1　样品采集、处理和保存采集动物全血样品后，室温静置约30min，使血液自然凝固。5000×g离心10min，收集上清液转移至另一离心管中，于56℃水浴中作用30min后，待血清样品恢复室温后用于检测。血清样品也可放4℃暂时保存或-80℃保存备用

8、。2　样品检测9.1从2~8℃冰箱中取