地高辛标记探针的southern 杂交

地高辛标记探针的southern 杂交

ID:15958547

大小:105.00 KB

页数:6页

时间:2018-08-06

地高辛标记探针的southern 杂交_第1页
地高辛标记探针的southern 杂交_第2页
地高辛标记探针的southern 杂交_第3页
地高辛标记探针的southern 杂交_第4页
地高辛标记探针的southern 杂交_第5页
资源描述:

《地高辛标记探针的southern 杂交》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在行业资料-天天文库

1、地高辛标记探针的Southern杂交(DIGHighPrimerDNALabelingandDetectionStarterKitI,Cat.No.11745832910,RocheDiagnosticsGmbH,Germany)1.探针标记步骤(20µl体系):1)将10ng-1µg这个需要测好。可能是1µl也可能是4µl。还可以是300ng-3µg。模板DNA用无菌去离子水补足至16µl。2)沸水浴或干浴锅98℃10分钟,使DNA变性成单链并迅速冰浴冷却。3)充分混匀DIG-highPrimer(1#管),并取4µl至变性DNA管,混匀并离

2、心?10秒钟,离心到管壁无水挂即可。。4)37℃温育1小时或过夜(最大到不超过20小时)。5)停止反应,加2µl0.2MEDTA(pH8.0)或65℃加热10分钟-20℃保存备用。。2.探针标记效率检测:将地高辛标记好的探针作一系列的稀释,点到一条尼龙膜上,同时用地高辛标记的controlDNA作对照标准,120℃固定30分钟;然后用地高辛抗体免疫检测,按BNT/BCIP显色步骤显色;比较显色结果,选择带有可以接受的背景的最高探针浓度做正式的杂交。操作步骤如下:1)根据表1DIG-HighPrimeDNA标记及检测试剂盒理想条件下探针的标记产量

3、将标记的探针稀释到1ng/μl,将试剂盒提供的controlDNA稀释到1ng/μl(原始浓度是5ng/μl),然后按照表2作一系列的稀释探针及controlDNA表1DIG-HighPrimeDNA标记及检测试剂盒理想条件下探针标记产量TemplateDNA1h20h10ng45ng600ng30ng130ng1050ng100ng270ng1500ng300ng450ng2000ng1000ng850ng2300ng3000ng1350ng2650ng表2探针DNA及ControlDNA系列表TubeDNA(µl)FromTube#DNAd

4、ilutionbuffer(μl)DilutionFinalconcentration1 Dilutedorginal  1ng/µl2211981:10010pg/µl3152351:3.33pg/µl452451:101pg/µl553451:100.3pg/µl654451:100.1pg/µl755451:100.03pg/µl856451:10总的稀释比例是:1:1050.01pg/µl90-50-01)将上述稀释的2-9号管的controlDNA及探针DNA各取1μl点膜2)120℃固定30分钟或紫外交链3-5分钟3)将膜放入装有2

5、0mlMaleicacidbuffer的塑料器皿中,室温振荡2分钟4)将膜放入10mlBlockingsolution中室温温育30分钟5)将膜放入10mlAntibodysolution中室温温育30分钟6)用10mlWashingbuffer洗2次,每次15分钟7)在10mlDetectionbuffer平衡2-5分钟8)将膜放入2ml新配制的Colorsubstratesolution中暗室条件下显色。显色过程中不要摇动或振荡9)当斑点或带显示出来后,用50ml灭菌的双蒸水洗膜5分钟,照相染色至0.1pg的ControlDNA出现斑点,比

6、较标记的探针与ControlDNA染色情况计算出地高辛标记的DNA的量:如果0.1pg的探针及对照稀释点都显色,则探针标记理想;如果0.1pg的对照显色,0.1pg的标记探针没显色,但0.3pg显色,则计算探针浓度(约为理想浓度的1/3)以确定杂交时加多少探针(25ng探针/ml杂交液);如果0.1pg的对照显色,但标记探针0.3pg的斑点没显色,则应重新标记探针。(转膜被省略。Capillarytransfer1%琼脂糖凝胶,40V电泳过夜,切角标记。对于植物基因组,去嘌呤实验不要超过20min。)去嘌呤缓冲液:placethegelinap

7、lastictray.coverwith250mMHClpartialdepurination.agitategentlyuntilthebromophenolblue溴酚蓝dyeturnsyellow(5minutes).agitateafurther15minutesandrinsewithdistilledwater.碱变性液:1.5mol/LNaCl,0.5mol/LNaOH中和液:0.5mol/LTris-HCL(pH=8.0),1.5mol/LNaCl20×SSC:2mol/LNaCl,0.3mol/L柠檬酸钠(pH=7.0)2×S

8、SC:0.3mol/LNaCl,0.03mol/L柠檬酸钠(pH=7.0)关于凝胶处理Note:donotputethidiumbromideinto

当前文档最多预览五页,下载文档查看全文

此文档下载收益归作者所有

当前文档最多预览五页,下载文档查看全文
温馨提示:
1. 部分包含数学公式或PPT动画的文件,查看预览时可能会显示错乱或异常,文件下载后无此问题,请放心下载。
2. 本文档由用户上传,版权归属用户,天天文库负责整理代发布。如果您对本文档版权有争议请及时联系客服。
3. 下载前请仔细阅读文档内容,确认文档内容符合您的需求后进行下载,若出现内容与标题不符可向本站投诉处理。
4. 下载文档时可能由于网络波动等原因无法下载或下载错误,付费完成后未能成功下载的用户请联系客服处理。