三七蛋白的提取和体外免疫调节活性研究

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1、三七蛋白的提取和体外免疫调节活性研究何慧楠睢博文刘莉齐滨赵大庆（长春中医药大学，吉林长春）摘要:目的提取三七蛋白，并研究其对小鼠巨噬细胞的免疫调节活性。方法采用中性盐缓冲溶液提取三七蛋白，采用lowry法测定蛋白含量并利用SDS-PAGE电泳法测定三七蛋白的亚基分子量分布。以小鼠巨噬细胞RAW264.7为模型研究三七蛋白对细胞吞噬能力的影响，刺激产生NO含量，释放IL-6、TNF-α来考察其对巨噬细胞免疫活性的影响。结果用lowry法测定三七蛋白的蛋白含量为1.95mg/mL，三七蛋白的亚基分子量从18k

2、D到63kD。三七蛋白可通过增强巨噬细胞吞噬能力，释放免疫因子等方面增强巨噬细胞免疫活性。关键词:三七蛋白；巨噬细胞；免疫调节三七为五加科植物三七（Panaxnotoginseng(Burk)F.H.Chen）的干燥根及根茎。三七被人们称为“金不换”，具有止血、散瘀、消肿、止痛等功效[1]。三七中的化学成分复杂，主要包括皂苷类、挥发油类、氨基酸类、黄酮类、糖类、蛋白质及多肽、无机盐类等[2-6]。现代药理学研究表明，三七具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、抗辐射、降血糖等活性，并对其他药理活性起着协同调节作用[

3、7-9]。三七中的皂苷成分被认为是三七的主要活性成分，但是近年来的研究表明，三七多糖等大分子也具有明显的生物活性[10-12]，而这些大分子往往被人们所忽视。本研究针对三七当中的大分子物质蛋白质进行提取和性质检测，并以小鼠巨噬细胞为研究对象，对三七蛋白体外的免疫调剂活性进行初步的探索研究，为把三七蛋白开发成保健食品的原料提供科学的依据。1材料与方法1.1试剂和仪器DMEM培养基，购于Gibco公司，MTT，购于Thiazoly公司，DMSO，天津天泰精细化学品有限公司，TNF-α酶联免疫测定试剂盒、IL-

4、6酶联免疫测定试剂盒，购自上海朗顿生物科技有限公司，脂多糖（LPS）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、十二烷基磺酸钠（SDS）均购于Sigma公司。Infinite200Pro型酶联免疫检测仪，购自瑞士TECAN公司，3111型CO2培养箱购自ThermoForma公司。1.2细胞株小鼠巨噬细胞样细胞株RAW264.7（ATCCTIB-71），购买于购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。1.3实验方法1.3.1三七蛋白的提取称取粉碎后的三七粉500g，加入浓度为0.01mol/L，pH9.0的Tri

5、s-HCl缓冲溶液5000mL，4℃浸提，浸提24h后，用绢布过滤浸提液，滤渣加入5000mLTris-HCl缓冲溶液（0.01mol/L，pH9.0）4℃浸提24h，用两层绢布过滤浸提液，合并浸提液，4000r/min离心20min，收集上清。用中空纤维膜过滤系统超滤（0.45um）和微滤（MW10000）浸提液，收集大分子滤液，向滤液中缓慢加入(NH4)2SO4，使饱和度达到75%，4℃沉淀12h后，4000r/min离心20min，收集沉淀，用少量蒸馏水溶解，透析（MW8000），冻干，即得三七总蛋

6、白（NGP）。1.3.2三七蛋白的含量测定采用lowry法测定蛋白含量，按照试剂盒使用说明书测定三七蛋白的含量。1.3.3三七蛋白分子量分布测定采用SDS-PAGE电泳测定三七蛋白的亚基分子量分布。1.3.4细胞吞噬能力实验5取对数生长期的RAW264.7细胞制成细胞悬液，细胞密度为6×105个/mL接种于96孔板，每孔100μL，置于37℃，5%CO2的培养箱中培养6h。待细胞贴壁后加入不同浓度药物每孔20μL，补加80μL培养基，每个浓度设6个复孔，空白组以同体积无菌PBS代替，阳性对照组加入同体积2

7、0μg/mLLPS，培养24h。用中性红吞噬实验检测细胞吞噬能力，每孔加入100μL0.075%的中性红溶液，继续孵育1h后，吸出孔内培养基，用PBS吸去残留中性红，加入150μL90%乙酸乙醇裂解液，充分混匀，测定每孔在550nm处的光度值（OD）。1.3.5NO含量检测取对数生长期的RAW264.7细胞制成细胞悬液，细胞密度为2×106个/mL接种于96孔板，每孔100μL，置于37℃，5%CO2的培养箱中培养6h。待细胞贴壁后加入不同浓度药物每孔20μL，补加80μL培养基，每个浓度设6个复孔，空白

8、组以同体积无菌PBS代替，阳性对照组加入同体积20μg/mLLPS，培养24h。采用Griess法测定NO含量：标准孔加入浓度为100μmol/L的亚硝酸0、10、20、30、40、50μL，加蒸馏水补足50μL，样品孔分别加入各组培养基50μL，之后再加入50μLGriess试剂，振摇10min，测定各孔于540nm处的光度值（OD），根据标准孔绘制出亚硝酸浓度与光度值的标准曲线，并计算个样品孔NO浓度。1.3.6IL-6、