转基因技术及应用

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1、动物转基因技术7.3.1转基因技术相关概念1.转基因：在DNA操作过程中整合到宿主细胞染色体上的外源基因转基因技术包括下列：转基因的重组子构建技术-------构重组分子导入宿主休内的转化技术-------转转基因在受体细胞染色体上的稳定整合-------整转基因的可控性表达技术-------表2.转基因生物（GMO或TO）：含有转基因并为其遗传修饰了的动植物发育个体转基因动物(TransgenicAnimal)是指通过实验方法，人工地把人们想要研究的动物或人类基因，或者是有经济价值的药物蛋白质基因等，通常称为外源基因，导入动物的受精卵（或早期胚胎细胞），使之与

2、动物本身的基因组整合在一起，这样外源基因能随细胞的分裂而增殖，并能稳定地遗传给下一代的一类动物。（曾溢滔院士）3,转基因动物转基因动物是指用实验导入的方法将外源基因在染色体基因内稳定整合并能稳定表达和遗传的一类动物（包括基因敲除的动物）。1982年，华盛顿大学制备的著名“超级小鼠”－将大鼠生长激素导入小鼠转基因动物技术是指借助基因工程技术将体外重组的结构基因导入受精卵或早期胚胎，培育出转基因动物的技术。4，转基因动物技术7.3.2转基因动物技术的发展简史回顾1、第一例嵌合体小鼠1974年最早把猿猴病毒40(SV40)注入小鼠囊胚腔中（如图），得到部分组织中含有S

3、V40DNA的嵌合体小鼠。但无任何表型改变。2、第一个转基因小鼠系1976年建立了世界上第一个转基因小鼠系，这些小鼠基因组中插入了莫氏白血病病毒基因。他们是运用反转录病毒与小鼠卵裂球共培养把外源DNA插入到小鼠的基因组中。3、第一例显微注射法产生转基因小鼠1980年，Gordn等把SV40DNA显微注射到小鼠受精卵的原核中，获得了两只转基因小鼠，创建了显微注射转基因方法。4、“超级鼠”1982年，Palmiter和Brinster用此方法把大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵，获得了成年体重是对照组小鼠2倍的“超级鼠”，首先证明外源基因可在受体中表达，并且表达产物具

4、有生物活性。5、转基因家畜的产生转基因家兔、绵羊和猪(Hammer等，1985)、牛(Bondioli等，1988)和山羊(Ebert等，1991)等相继出世。6、利用转基因生产重组蛋白1987年，Simons等在转基因小鼠的乳汁中得到绵羊的β-球蛋白，1988年，该研究小组又从转基因绵羊的乳汁中得到了α-抗胰蛋白酶。目前，已有数十种蛋白实现了转基因生产。7、转YAC的转基因小鼠近10年内，陆续出现用全长酵母人工染色体（YAC）DNA来产生转基因小鼠。转基因动物实例一超级奶牛－普通奶牛的三倍大（英国）转基因动物实例二东北农业大学－国内首例绿色荧光蛋白“转基因”克

5、隆猪绿色荧光蛋白－猪胎儿成纤维细胞－克隆转基因动物实例三转绿色荧光蛋白的兔转基因动物实例四正在进行转基因山羊的实验乳汁中分泌人凝血因子IX的转基因山羊上海交通大学医学遗传研究所justajoke7.３.3转基因动物操作技术流程获取外源目的基因含有外源目的基因的重组载体导入生殖细胞或胚胎干细胞选择携带目的基因的细胞，选择体外培养系统和宿主动物转基因胚胎的发育及鉴定筛选所得的转基因动物简明操作步骤转基因技术操作的具体流程一、目的基因的设计转基因可分为随机整合型基因和基因敲除（geneknockout）型载体基因。随机整合型基因要求结构完整，包括5‘上游启动子区和3’

6、下游区等，多用基因组文库（如BAC文库）筛选。也可人为改造基因，改造基因可选择不同的启动子来控制外源基因表达的组织特异性。基因敲除（geneknockout）型载体基因要设计与待剔除基因的同源性的载体基因。二、重组载体的构建选择合适的基因载体，要求载体序列不干扰外源基因的表达、能接受外源DNA容量大小、稳定、有一定滴度、对宿主细胞无威胁。三、重组载体的体外验证（invitro）重组载体的正确性验证，如拷贝数、连接方向等。对于连有组织特异性启动子或局部体细胞转染的载体，需先在同类型的体外离体培养细胞中初步验证表达特性。四、基因转移基因转移方法主要有3类：1）化学法

7、2）物理法3）生物法五、转基因动物模型的验证国外杂志一般需要从基因组、mRNA、蛋白质和整体表型各个层次进行验证。FISH杂交、聚合酶链反应（PCR）、免疫印迹杂交（SouthernNorthernblotting）、酶联免疫法、免疫荧光法和Western杂交法等多种方法，先筛选出有外源基因整合的阳性动物，传代后分别在mRNA和蛋白水平上检测外源基因在转基因动物中的表达情况，对外源基因表达产物的生物活性和生化性质进行鉴定，以及检查转基因动物的生理功能和是否出现某些疾病症状的表型等。六、组建转基因系第一代转基因动物是半合子转基因动物，因为外源基因仅在一条染色体上稳

8、定整合。只有通过选种选配