gm试验培训课件_ppt课件

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1、GM试验培训课件市场部2014年8月GM试验培训课件市场部曲霉菌简介及曲霉菌感染现状GM试验的检测原理GM试验的检测步骤GM试验的注意事项及影响因素4GM试验与G试验的联合检测56GM试验适用的科室132LinSJ,etal.JClinInfectDis,2001,32(3):358-366烟曲霉黄曲霉黑曲霉定义：曲霉菌(Aspergillus)是广泛存在于自然界一种腐生菌，孢子较小直径2-3um，可在空气中漂浮，可通过呼吸道进入人体。多种曲霉菌都可引起侵袭性曲霉病，如烟曲霉、黑曲霉、土曲霉、黄曲霉和构巢曲霉等

2、。一、曲霉菌简介（一）曲霉菌感染现状曲霉感染不容忽视TortoranoAMetal.Mycoses.2011,55:73–79.38个ICUsof27个意大利医院384例真菌感染(318例侵袭性念珠菌感染；63例霉菌感染；3例隐球菌感染)曲霉感染57例毛霉菌感染4例镰刀菌感染1例木霉菌感染1例霉菌感染的比例为16%（二）曲霉菌感染现状曲霉感染死亡率高死亡率(%)全因死亡率归因死亡率(曲霉)时间(周)二ＧＭ的检测原理ELISA方法简介酶联免疫吸附测定技术(Enzyme-LinkedImmunosorbentAss

3、ay,ELISA)是以抗原、抗体的特异性结合反应为基础，将抗原或抗体的检测与酶对底物的高效催化作用结合起来的一种敏感性很高的免疫检测技术。曲霉菌抗原检测采用了间接竞争法。ELISA试验操作过程由样本处理、加样、孵育、洗涤、显色、终止等几个基本环节组成。（一）ＧＭ的检测原理三实验操作流程GM实验所需的仪器及耗材1.酶标仪：必须能使用450nm波长用于检测。2.高速离心机：必须达到10000g离心力以上，最好是低温离心机。3.37℃恒温培养箱（或其他可替代的恒温空气浴设备）必须设置温度为37℃，其他温度（如35℃）

4、不可以使用，否则会影响检测值，同时要保证恒温箱的洁净。4.沸水浴：一般的电磁炉或者其他可以保证沸水浴的设备皆可，但暂不推荐干浴5.漩涡混合仪6.100μL和300μL多道移液器（排枪）及配套吸头：可以减少不同孔的加样时间差。如果使用洗板机，无需用300μL多道移液器。7.100μL和1000μL单道移液器及配套吸头8.配制洗液的量筒和保存洗液的试剂瓶9.封板膜：需用户根据每盒试剂做实验次数自备一部分备用10.浮漂：沸水浴使用（一）试剂盒组成试剂盒组成：酶标板标准品半乳甘露聚糖抗体半乳甘露聚糖抗体稀释液酶标抗体酶

5、标抗体稀释液底物溶液终止液封板膜存储条件：2-8℃冷藏保存试剂规格：96人份/盒（一）试剂盒组成（二）GM实验操作流程图孵育加酶标抗体加50μL终止液并读数37℃,40min37℃,20min洗板后加100μL酶标抗体37℃,60min样本检测各取50μL样本和半乳甘露聚糖抗体加入酶标板中预处理混匀，100℃水浴3min待测样本(300μL)样本处理液(100μL)+4℃，10000g离心10min取上清检测显色终止洗板后加100μL显色液样本处理1.向离心管中加入300μl待测血清。2.向离心管中加入l00μ

6、l样本处理液R5。3.漩涡震荡10s以彻底混匀，将离心管放入水浴锅100℃加热3min。4.将离心管从水浴锅内取出，小心放入离心机内，10000r离心10min。5.取上清液50μl用于检测。（三）GM实验操作流程取300μL血清100μL处理液+样本处理示意图沸水浴3min1.实验前将试剂盒取出置于室温30min2.配液：（1）洗涤工作液：浓缩洗液稀释20×（l份浓缩洗液R6加l9份的无菌去离子水或超纯水）（2）半乳甘露聚糖抗体工作液：半乳甘露聚糖抗体稀释100×（l份半乳甘露聚糖抗体R3b加99份的半乳甘露

7、聚糖抗体稀释液R3a）；（3）酶标抗体工作液：酶标抗体50×（l份酶标抗体R4b加49份的酶标抗体稀释液R4a）；（三）GM实验操作流程3.样本混合：（1）分别设标准曲线组、待测样本组。标准曲线组：各标准品分别取50μl加入到酶标板孔中。待测样本组：处理后的待测样本各取50μl分别加入到酶标板孔中。（2）向酶标板孔中分别加入半乳甘露聚糖抗体50μl。（3）另设空白对照1孔，加入样本稀释液l00μl，封上封板膜，37℃下孵育60±1min。4.洗涤酶标板：揭开封板膜，洗涤酶标板。每孔每次加入250μl的洗液，静置

8、2min后，将酶标板孔内的液体除去，在吸水纸上反复拍打以去除残留液体，重复上述洗涤操作，共洗涤3次。5.加入稀释后的酶标抗体：洗涤结束后，每孔加入酶标抗体100μl。用封板膜封板，37℃下孵育40±1min。6.洗涤：同步骤47.显色：洗涤结束后，每孔加入底物溶液100μl，不用封板膜封板，在37℃下孵育20min，避光。8.终止：每孔加入50μl终止液，加样顺序与加入底物顺序相同，混