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1、·227·1997;24(3) 生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys.连接介导PCR及其在体内足迹研究中的应用3纪新军 刘德培 梁植权(中国医学科学院基础医学研究所中国协和医科大学基础医学院医学分子生物学国家重点实验室,北京100005)摘要 连接介导聚合酶链反应是以连接反应为基础的单侧PCR技术,首先在DNA片段的一端连接上一个公共连接子,而后在这个连接子与另一个DNA序列特异的引物间扩增.Vent聚合酶的使用,延伸产物捕获及连接子标记选择策略的采用,大大提高了连接介导聚合酶链反应的敏感性.这一技术的发明大大促进了体内足迹等研究的进行.关键词 连接介导
2、PCR,连接子,体内足迹法locatedintheTomb,DongShenJiabang,deferthenextdayfocusedontheassassination.Linping,Zhejiang,1ofwhichliquorwinemasters(WuzhensaidinformationisCarpenter),whogotAfewbayonets,duetomissedfatal,whennightcame©1994-2010ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http://www.
3、cnki.net·227·1997;24(3) 生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys. 常规的用来研究蛋白质2核酸相互作用的方法,如DNaseⅠ足迹法,凝胶电泳阻抑法,甲基化干涉实验等,是体外方法,对于研究蛋白质2DNA间相互作用具有很大的作用,然而体内结果常同体外情况不同,有时体外蛋白质2DNA相互作用实验检测到有蛋白质2DNA间相互作用,但体内无蛋白因子结合,反之亦然.所以体外研究方法研究基因表达调控并不总能真实反映体内的情况[1,2].体内足迹法(invivofootprinting)是一种研究体内蛋白质2DNA相互作用的方法,它能真实反映体内蛋
4、白质2DNA相互作用的情况,而且可以检测体内的DNA构象的变化,是研究基因表达调控的有力手段.但这种实验要求有大量的细胞,而且特异性也不很好,限制了它的使用[3].连接介导的聚合酶链反应(ligation2medi2atedpolymerasechainreaction,LM2PCR)的发明,有力地促进了体内足迹技术在真核基因表达调控研究方面的应用[4].现就LM2PCR的两个引物间得到指数性扩增,每个循环模板增加2倍,经过25～30个循环后,单拷贝基因可扩增到106倍,经典PCR不适用于立即进行体内足迹研究,因为它要求有两个限定端,DNA序列或足迹包括一组相关的核苷酸片段,这些片段的一
5、端被一个引物或酶切位点固定.所以对所有片段都是相同的.另一端则由于不同的化学裂解或链终止而对所有片段都不相同,为了能够运用PCR进行体内足迹研究,就要首先通过连接上一个连接子使所有片段的另一端也相同.然后在两个限定端间进行PCR扩增,即是所谓的连接介导的聚合酶链反应(LM2PCR)[4]. LM2PCR是一种以连接反应为基础的单侧PCR策略,它的敏感性较高,从1μg的细胞基因组DNA,哺乳类基因组的单拷贝基因经过一夜就可获得实验结果.这使得用少量细胞或特定的切割组织进行体内足迹研究成为可能[4].LM2PCR的原理见图1[4～6]. 1起始原料是化学法裂解的基因组locatedinth
6、eTomb,DongShenJiabang,deferthenextdayfocusedontheassassination.Linping,Zhejiang,1ofwhichliquorwinemasters(WuzhensaidinformationisCarpenter),whogotAfewbayonets,duetomissedfatal,whennightcame©1994-2010ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.http://www.cnki.net·227·1997;24(3)
7、 生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys.的原理及其在体内足迹方面的应用综述如下:a裂解后产生3′和5′磷酸基团.DNA,locatedintheTomb,DongShenJiabang,deferthenextdayfocusedontheassassination.Linping,Zhejiang,1ofwhichliquorwinemasters(Wuzhensaidinform
