靶向GnRH基因的microRNA的筛选及其功能研究

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1、靶向GnRH基因的microRNA的筛选及其功能研究学校代码：10255学号：2150471东华大学DONGHUAUNIVERSITY硕士学位论文MASTERTHESIS靶向GnRH基因的microRNA的筛选及其功能研究SCREENINGANDFUNCTIONALANALYSISOFMICRORNATARGETINGGNRHGENE学科专业生物化学与分子生物学作者曲妍佳指导教师周宇荀副教授答辩日期2018年1月18日靶向GnRH基因的microRNA的筛选及其功能研究靶向GnRH基因的microRNA的筛选及其功能研究靶向GnRH基因的micro

2、RNA的筛选及其功能研究靶向GnRH基因的microRNA的筛选及其功能研究摘要背景：MicroRNAs（miRNAs）是一类内源性、功能性、长度在19-23nt的非编码单链小RNA，并在哺乳动物发育过程中起基因调控作用。成熟的miRNA与靶基因mRNAs的3’非翻译区（3’UTR）结合，抑制靶基因蛋白的翻译，或通过诱导mRNA降解，来调控基因的表达。miRNA参与细胞增殖与凋亡、胰岛素分泌以及个体发育等过程。在哺乳动物体内，性发育启动受到下丘脑-垂体-性腺轴（HPG轴）的调控，其所分泌的各种激素水平可以直接调控性发育启动并维持机体的生殖功能。下丘

3、脑GnRH神经元脉冲式分泌GnRH，是性发育启动的关键性事件。当性发育启动时，GnRH神经元分泌GnRH的频率和脉冲幅度都显著提高。越来越多的证据证明，在性发育启动中起到至关重要作用的是基因的时空表达。而微小RNA（microRNAs/miRNAs）可以在多个层面调节基因的表达，因此可以调控性发育的不同通路。本实验室一直致力于研究小鼠性发育调控的遗传和分子机制，发现有许多microRNA参与了这一重要的生命过程的调控。目的：在来源于下丘脑GnRH神经元的GT1-7细胞中，构建一种高度灵敏的GnRH表达调控报告系统，通过检测调控因子处理之后的I靶向G

4、nRH基因的microRNA的筛选及其功能研究荧光强度的变化来衡量其对GnRH的调控能力。通过双荧光素酶的报告系统筛选靶向GnRH的miRNA，检测miRNA在不同组合模式下，对GT1-7细胞中的GnRH表达量影响。这种不同的组合作用可以模拟生物的基本生理状态，探究miRNA对GnRH的调控作用，深入解析其调控途径，从而完善性发育基因调控网络。方法：通过CRISPR/Cas9系统可将GnRH上下游同源臂和绿色荧光蛋白（EGFP）基因通过同源重组的方式插入PUC19载体上，构建成GnRH打靶载体。根据GnRH基因位置，通过CRISPR/Cas9系统设

5、计最符合条件的sgRNA，构建成sgRNA载体。在GT1-7细胞中，共转染两种载体，通过流式细胞仪分选阳性单克隆细胞，扩大培养成含绿色荧光的报告系统。通过Targetscan、mirDB、microRNAtargetprediction、mirwalk、PicTar、mirnada等数据库预测出靶向GnRH的7种miRNA，其中包括mmu-miR203-3p、mmu-miR574-3p、mmu-miR100-3p、mmu-miR370-5pmmu-miR148a-3p、mmu-miR148b-3p、mmu-miR152-3p。将GnRH全部的3’非

6、翻译区（3’UTR）构建在psi-check2载体上，构建成GnRH表达载体，与miRNAmimics一起瞬时转染293细胞，通过双荧光素酶的报告系统筛选了靶向GnRH的4种miRNA，并将筛选出的4种miRNAmimics转染GT1-7细胞，通过GnRH表达量检测进一步筛选，获得靶向GnRH的3种miRNA。为模拟生物体的生理状态，将三种浓度相同的miRNAmimics按不同的组合模式转染GT1-7细胞，检测其对GnRHII靶向GnRH基因的microRNA的筛选及其功能研究及其它性发育相关基因表达量的影响。结果：已成功构建一种高度灵敏的GnRH

7、表达调控报告系统，在转染GT1-7细胞后，经过流式细胞仪检测到荧光值的变化，但经过流式细胞分选时，未能分选出荧光细胞。在293细胞中，通过双荧光素酶的报告系统筛选出靶向GnRH基因的4种miRNA，其中包括mmu-miR203-3p、mmu-miR574-3p、mmu-miR100-3p、mmu-miR370-5p将4种miRNA在GT1-7细胞中进一步实验，筛选出除mmu-miR203-3p以外的三种miRNA。为了模拟生物的基本生理状态，检测在不同组合模式下miRNA对GnRH及性发育相关基因的检测，结果显示，单个miRNA转染，两两联合转染和

8、三个联合转染对GnRH的表达有不同程度的影响，且联合转染比单个转染对GnRH的影响更有效，对其他性发育相关基因的表达也有影