RNA干扰ERCC1基因表达对卵巢癌细胞耐药的影响.doc

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1、RNA干扰ERCC1基因表达对卵巢癌细胞耐药的影响【关键词】RNA干扰；,,ERCC1基因；,,卵巢癌；,,耐药　　摘要：目的：观察RNA干扰沉默ERCC1基因对卵巢癌细胞耐药的影响。方法：体外合成靶向于ERCC1基因的小干扰RNA(ERCC1-siRNA),用脂质体法转染至卵巢癌耐药细胞系COC1/DDP,RT-PCR方法检测转染前后细胞内ERCC1mRNA的表达，Westernblot方法检测ERCC1基因蛋白表达的改变，MTT实验检测转染前后COC1/DDP细胞对顺铂敏感性的变化。结果：转染ERCC1-siRNA后，COC1/DDP细胞中ERCC1基因的mRNA和蛋白表

2、达均明显减少。RNA干扰联合顺铂用药能明显提高COC1/DDP细胞对顺铂的敏感性。结论：RNA干扰ERCC1基因能明显抑制COC1/DDP细胞内ERCC1基因mRNA和蛋白的表达，增加COC1/DDP细胞对化疗药顺铂的敏感性。　　关键词：RNA干扰；ERCC1基因；卵巢癌；耐药　　EffectonCytotoxicitybyRNAiERCC1GeneExpressioninOvarianCancerCelILine　　Abstract：Objective:TostudytheeffectondrugresistancebyRNAimediatedERCC1genesilenc

3、inginovariancancercellline.Method:SmallinterferenceRNAtargetedERCC1genewassynthesizedinvitroandwastransfectedintoCOC1/DDPcell．TheexpressionofERCC1wasdetectedbysemi-quantitativereversetranscription-polymerasechainreaction(RT-PCR)andwesternblot.MTTtestwereappliedtomeasuretheinhibitioncombined

4、withcisplatinofCOC1/DDPstrain．Result：AftertransfectionofERCC1-siRNA,mRNAandproteinlevelsofERCC1geneinCOC1/DDPcellswereobviouslyreduced；ERCC1genecombinedwithcisplatinincreasesthesensitivitytochemotherapy．Conclusion:ERCC1-siRNAcouldreducetheexpressionofERCC1geneandincreasethesensitivitytocisp

5、latininCOC1/DDPcell.　　Keywords：RNAi;ERCC1gene;Ovariancancer;Drug-resistance　　卵巢癌是妇科最常见的恶性肿瘤，其5年生存率仅为20%～30%。治疗的难点为卵巢癌细胞对化疗药物―尤其是一线化疗药顺铂产生耐药性，严重阻断了化疗药物的抗肿瘤效应。ERCC1基因是核苷酸切除修复(nucleotideexcisionrepair，NER)基因家族成员之一，与卵巢癌化疗耐药密切相关［1］。ERCC1基因表达上调是卵巢癌顺铂耐药的重要原因。RNA干扰（RNAinterference,RNAi）技术是近10年出现的一种

6、研究基因功能和进行基因治疗的一种新方法，是外源双链RNA(double-stranded5RNA，dsRNA)分子在mRNA水平沉默靶基因，阻断基因的表达［2］。由于RNAi具有序列特异性和高效性，目前已成为抗肿瘤基因治疗的有效手段。本研究根据ERCC1基因高表达于卵巢癌耐药细胞以及RNAi高效特异抑制目的基因的特点，针对ERCC1基因设计合成小干扰RNA（siRNA），在脂质体的介导下转染人卵巢癌耐药细胞系COC1/DDP，以RT-PCR及Westernblot方法检测RNA干扰前后细胞内ERCC1基因mRNA及蛋白表达水平的改变。采用MTT实验检测RNA干扰ERCC1基因

7、后卵巢癌耐药细胞系COC1/DDP对顺铂敏感性的改变，以探讨逆转卵巢癌化疗耐药的新方法。　　1材料与方法　　1.1材料与试剂：卵巢癌耐药细胞株COC1/DDP购自中国典型培养物保藏中心。RNA干扰试剂盒购自美国Ambion公司。阳离子脂质体转染试剂盒Lipofectamine2000、TrizolRNA提取试剂盒、M-MLV逆转录试剂盒购自Invitrogen公司。RPMI-1640培养基、胎牛血清购于GIBCO公司。ERCCI鼠抗人单克隆抗体、羊抗鼠IgG-HRP、Actin(1～19)多克隆抗体SA