烟草芜菁花叶病毒的elisa和rt-pcr快速检测技术研究

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1、烟草芜菁花叶病毒的ELISA和RT-PCR快速检测技术研究烟草芜菁花叶病毒的ELISA和RT-PCR快速检测技术研究烟草芜菁花叶病毒的ELISA和RT-PCR快速检测技术研究烟草芜菁花叶病毒的ELISA和RT-PCR快速检测技术研究烟草芜菁花叶病毒的ELISA和RT-PCR快速检测技术研究758两南农业SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences2007年20卷4期V0L20No,4文章编号:1001-4829(2007)04—0758—04烟草芜菁花叶病毒的ELISA和RT.PCR快速检测技术研究周

2、利飞,刘映红’,孙现超,申艳芝(西南大学植物保护学院,重庆市昆虫学及害虫控制工程重点实验室,重庆400716)摘要:采用间接ELISA和RT.PCR,建立了烟草芜菁花叶病毒(nl丌lmosa/ev/ms,TuMV)快速检测的技术体系.间接ELISA测定结果表明,TuMV多抗按1:3000浓度稀释后,具有较高的检测灵敏度,其检测极限浓度为1:3215;通过改进RNA提取技术,从少量的烟草病叶中提取出高质量总RNA,进行eDNA合成及PCR扩增,得到一条长度约986bp的特异PCR扩增产物,与理论设计的大小一致,可有效地对田间烟株进行快速检测.关

3、键词:芜菁花叶病毒;间接EUsA;RT-PCR;快速检测中圈分类号:$572文献标识码:AStudiesontechniquesofrapiddetectingTurn//,MosaicVirusininfectingtobaccowithELISAandRT-PCRZHOULi-fei.LIUYing-hong’,SHUNXian-ehao,SHENYah-zhi(ChongqingKeyLaboratoryofEntomologyandPestControlEnnetting,SouthwestUniversity,Chongqing40

4、0716,China)Abstract:IndirectELISAandRT—PCRtechniqueweIeestablishedfortheRAPDdetectionofTurnipmosaicvirusinfectingtobacco.There.suitofindirectELISAshowthattheoptimumworkingconcentrationofpolyelonalantibodyofTuMVWaSdilutedin1:3,000,thecriticalde-tectionconcentrationwa81:3215.

5、TheintegratedandpureRNAwa8obtainedhDmabitofiff~tedtobaccoleaves.Theexpectedsize986bpW88amplifiedbyPCRfromthe~verscproduct.whilenoamplifiedproductsweIeobtainedfromthehealthytissuesamples.Keywords:turnipmosaicvirus;indirectELISA;RT-PCR;rapiddetection烟草是重庆的重要经济作物之一,近年来烟草花叶病毒病在

6、重庆发生普遍,且有逐年加重的趋势,在各烟区发生率为3O%～4O%,个别地区5O%以上,导致烟叶的产量和质量下降,严重制约重庆烟区的烟叶生产.2005年青玲等首次报道TuMV在田间侵染烟草…,且与TMV,CMV,PVY侵染烟草的花叶症状难以区分,因而准确有效快速检测烟田TuMV感染的烟草病株对制订防治措施具有重要意义.芜菁花叶病毒(rurn~mosaicvirus,TuMV)属马铃薯Y病毒科(Potyvifidae)马铃薯Y病毒属(P0v/msY),主要侵染十字花科作物,茄科作物也在其寄主范围之内】.本研究采用以抗原——抗体特异性结合为基础的E

7、LISA方法和反转录一聚合酶收稿日期:2006—12—22基金项目:重庆市烟草公司项目作者简介:周利飞(1982一),男,在读硕士,专业方向:农业昆虫及害虫综合防治,?为通讯作者.链式反应——RT—PCR技术,建立一套快速,准确的检测方法,可应用于田间烟草芜菁花叶病毒的快速检测,鉴定.l材料与方法1.1材料2006年6月从重庆武隆采回的烟草病株.采样时取病株嫩叶,置于冰盒内带回,保存于-80~C超低温冰箱中.芜菁花叶病毒(TuMV)多克隆抗体购自浙江大学生物研究所;碱性磷酸酶标记的马抗小鼠IgG(H+L)购自ZSGB—BIO公司;反转录试剂盒

8、RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit购自Fermentas公司;Taq酶购自Takara公司.从感病烟叶进行ELISA和RT