实时荧光定量pcr在临床及科研中的应用

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1、实时荧光定量PCR在临床及科研中的应用主要内容1234RealTimePCR用途及原理RealTimePCR几种方法介绍RealTimePCR技术应用RealTimePCR应用实例差异显示结果验证定性分析绝对定量相对定量病毒和病原菌检测基因芯片结果验证siRNA效果确认mRNA表达量分析RealTimePCR用途操作简单，无需电泳，检测快速，降低污染几率，适用于大量样品检测，检测灵敏度高；可以在宽广范围内进行准确定量。生物品种鉴定病毒和病原菌定量分析导入基因拷贝数解析GMO定量检测SNP解析激发光发射光Ct值RealTimePCR原理使用RealTime

2、PCR扩增装置，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法RealTimePCR原理荧光阈值Threshold：突破背景荧光水平后的荧光值.阈限循环Ct：荧光信号达到阈值时的循环数.突破Ct以后，荧光以指数形式增加,然后线性增加，并最终进入平台期Ct值的特点：终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性RealTimePCR原理定量PCR通过Ct和初时模板量的关系进行定量。同一样品的96个重复的终点荧光强度差别很大，但是Ct相同。CycleC(t)RealTimePCR原理模板DNA量越

3、多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。RealTimePCR检测方法核酸染料技术代表：SYBRGreenI(SGI)荧光探针技术代表：TaqManprobeSYBRGreenI与dsDNA结合SGI与dsDNA结合后受激发荧光强度增加1000倍随着产物的积累，越来越多的SGI与dsDNA结合，使得荧光信号增强.llllPCRReactionProgressionllllllllllllReal-TimePCR检测原理(SY

4、BRGreenI法)SYBRGreenIPCR检测的特点优点仅需要一对引物，实验设计简单。扩增后可进行产物的熔解曲线分析，以确定特异性。实验成本低。不足特异性仅由引物保证。非特异性双链DNA也会产生荧光信号。不能用于多重Real-TimePCR。Real-TimePCR检测原理(TaqManprobe法)TaqMan探针为一寡核苷酸:5’端标记一个报告荧光基团(Reporter)，3’端标记一个淬灭荧光基团(Quencher)。F490nm520nmRQQlRQRQ1.PCR过程中，探针与模板的特定序列结合2.DNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性，将探

5、针水解，从而破坏荧光基团和淬灭基团之间的FRET3.照射报告基团发出可检测的荧光信号R4.随着PCR扩增的进行，荧光信号不断积累Real-TimePCR检测原理(TaqManprobe法)优点靶标特异的荧光信号高度的检测特异性可用于多重Real-TimePCR不足探针合成成本高TaqManprobe法PCR检测的特点SYBRGreenI法vsProbe法SYBRGreenI法优点：价格便宜、使用方便、无需合成特异性探针。缺点：引物要求高(要求特异性扩增)、不能进行多重PCR。Probe法优点：特异性强，能进行多重PCR。缺点：需要设计特异性探针，成本高、

6、有时设计困难。使用SYBRGreenI进行检测的问题点●SYBRGreenI与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如果反应体系中有非特异性扩增，非特异性DNA也将同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。●PrimerDimer的产生二条引物的3’端具有互补序列时，引物自身也会进行扩增，产生短链DNA片段（PrimerDimer）。3’3’5’5’5’5’3’3’GATCCTAGGATCCTAG使用SYBRGreenI进行定量PCR的KeyPointPrimer：设计合适引物，防止非特异性扩增，是使用SYBRGreenI进行定量PCR的KeyPoint。

7、RealTime进入SYBRGreenI时代设计合适的引物选择适当的反应条件使用良好的试剂保证以上条件，使用SYBRGreenI将会更加便宜，更为方便，并拥有良好的特异性。目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚体要求不严格。目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异性反应和引物二聚体要求严格。RealTimePCR用引物与普通PCR引物设计要求不同=>对引物设计要求严格普通PCR引物RealTimePCR引物RealTimePCR引物及探针设计扩增片段大小★80-150bp(尽量限制在300bp以内)Primer长度★17-25baseGC含量★

8、40-60%(最好45-55%)Tm值★★★两条引物的Tm值尽量接近，引用专用软