进口油菜籽茎基溃疡病菌检测鉴定方法

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1、进口油菜籽茎基溃疡病菌检测鉴定方法一、检测流程样品过筛阳性阴性PCR检测病菌分离PCR检测R检测挑选种子阴性阳性阴性阳性致病性测试阳性阳性检出L.maculans未检出L.maculans二、取样和过筛送检样品混匀，取1kg用作试验样品，用孔径2.5mm和1.5mm的网筛过筛试验样品，筛上物多为豆荚等植株残体，筛下物多为油菜籽碎片或小形种子。取筛上物、筛下物和种子各1-2g用于PCR初筛。三、PCR初筛建议使用如下方法，也可以使用其他成熟的PCR方法进行检测。取筛上物、筛下物和种子各1-2g，液氮研磨后各取样0.1-0.2g，分别提取DNA，用油菜油菜茎基溃疡病菌L.maculan

2、s特异性引物LmacF(5’-cttgcccaccaattggatccccta-3’)和LmacR(5’-gcaaaatgtgctgcgctccagg-3’)(Liuetal.2006)进行PCR检测，预期扩增产物为331bp。可选用常用的植物DNA提取试剂盒或真菌DNA提取试剂盒。两种样品DNA各取1μL分别进行PCR检测，重复3次。PCR反应总体积为30µL，包含：10mmol﹒L-1Tris-HCl；50mmol﹒L-1KCl（pH8.3）；1.5mmol﹒L-1MgCl2；dATP、dGTP、dCTP、dTTP浓度均为100µmol﹒L-1；引物浓度各为100nmol﹒L-

3、1；模板DNA为1µL；1.0UTaqDNA聚合酶（大连宝生物工程有限公司）。反应循环程序为：94℃3min；94℃30s，63℃30s，72℃30s，35个循环；最后72℃5min。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶1×TAE缓冲液中电泳，EB染色后用凝胶成像系统分析。四、种子挑选若PCR检测结果为阳性，挑选油菜籽或病残体进行分离试验。在解剖镜下挑选籽粒皱缩、干瘪、变色、残缺或有霉变的籽粒或病残体，每份种子样品挑选不低于500粒。五、培养基制备制备普通PDA培养基，加入链霉素或（和）青霉素，使抗生素浓度为每毫升50－100个单位，倒皿备用。六、分离培养将种子置于灭菌蒸馏水中室温浸泡处理

4、1天，转入-20℃下冷冻处理1天，1％次氯酸钠消毒5分钟，无菌水3次洗涤后置于PDA培养基上，25粒/皿，在20~25℃12h黑暗/12h光照（12小时光暗交替）条件下培养10天，从第5天开始观察种子周围是否有菌丝产生。七、形态观察逐粒检查籽粒的培养情况，对菌落边缘不整齐、有较多分枝白色菌丝、菌落上有结节状颗粒点的，置于解剖镜下观察，挑取见到的菌丝结制片观察。显微镜下分生孢子（Phomalingam）无色透明，椭圆形至纺锤形，两端常见各1个油球，孢子大小3.3～6×1.4～2.3(μm)。有上述形态特征的分离物，转入新的PDA培养基纯化培养。八、PCR检测取疑似分离物提取DNA，用

5、特异性引物如LmacF/LmacR进行PCR检测。九、致病性测试原则上应根据柯赫氏法则进行致病性测定。选取健康的宁优7号等感病油菜籽种植，在长出2片子叶后做致病性测试。将形态特征与油菜茎基溃疡病菌L.maculans形态特征相符且PCR检测阳性的分离物，用无菌水配制每毫升107个分生孢子液，针刺接种，黑暗保湿一天，置于15~20℃下生长观察（可剪掉生出的心叶）。接种5-8天后接种点附近出现圆形浅褐色枯死斑，稍凹陷，对发病子叶再做病原菌分离，如形态特征仍为L.maculans，即完成整个检测程序。十、结果判定分离物形态特征与L.maculans相符，PCR检测为阳性，可视为L.mac

6、ulans。慎重起见，可参考致病性测试结果。十一、菌株保存阳性分离物可转入PDA于4℃冰箱保存，或将菌丝块转入30%灭菌甘油中于-70℃保存。