副猪嗜血杆菌arcA基因调控功能的研究

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1、＋２Ｂ２０１２１９０６分类号Ｓ８５５．１学号ｆ矽Ｉ义＃雜｜襄業ＡＧＲＩＳＩＣＵＬＴＵＲＡＬＵＮＩＶＥＲＳＴＹＩＣＨＵＡＮ－＋．博士＂学位论文．■：、、了、．、■：■．．．．■？．．副猪嗜血杆菌基因调控功能的研究＇．：．＇■－．．．．．．；丁玲强．．？＾－？＇？？．．＞－，：．，ｊｉ．．’？？？■．．．指导教师文心田教授■．学科专业预防＃医学…？？．．．■．．研究方

2、向动物传染病；ＳｉｃｈｕａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＤＩＳＳＥＲＴＡＴＩＯＮＳｕｂｍｉｔｔｅｄｉｎＦｕｌｆｉｌｌｍｅｎｔｏｆｔｈｅＲｅｕｉｒｅｍｅｎｔｆｏｒｑＤＯＣＴＯＲＤＥＧＲＥＥＳｔｕｄｏｎｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆａｒｃＡｏｆＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓａｒａｓｕｉｓｙｐＢｙＬｉｎｉａｎＤｉｎｇｑｇｇＤｉｒｅｃｔｅｄｂｙＰｒｏｆ．ＸｉｎｔｉａｎＷｅｎＡｓｓｏｃｉａｔｅＰｒｏｆ．ＳａｎｉｅＣａｏｊＣｈｅｎｄｕ，ＳｉｃｈｕａｎｇＭａ２０１７ｙ，本

3、研究受下列基金项目资助特此表示感谢公益性行业（农业）科研专项项目副猪嗜血杆菌病和猪传染性胸膜肺炎防治技术研究与示范（项目编号：Ｎｏ．２０１３０３０３４）论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体己经发表或撰写过的研宂成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料一。与我同工作的同志对本研宂所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研宄生签名：年月曰Ｔ踩、糾乡

4、４７４关于论文使用授权的声明５：本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，卩学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。４论文不保密。□本论文保密，在年解密后适用本授权。＿“（请在以上□内划十）研究生签名：火年夕月曰丨７叫导师签名：年夕月巧日摘要副猪嗜血杆菌（Ｈａｅｗｏ／＾Ｚ／ＭＳｐａｒｃｗｗ＾ＨＰＳ）是猪革拉泽氏病（也称猪副猪嗜血杆菌病的病原

5、体，可导致多发性浆膜炎、脑膜炎、败血症等症状，病死率高，每年可）－－造成我国养猪业重大经济损失，是影响我国甚至全球养猪业的重要细菌性疫病之。。ＡｒｃＡ是迄今为止，对其毒力相关因子和致病机理了解不多许多细菌的全局调控因，除此之外子，还具有调节细菌的能量代谢、血，主要调控细菌的厌氧氧化还原平衡清抗性和细菌毒力等许多功能。本研究旨在以本地分离的副猪嗜血杆菌强毒株ＥＰ３（血清１３型）为亲本株，利用遗传操作技术构建了Ａａｒｄ缺失株，对其进行生物？学特性的研究，并利用比较转录组学和比较蛋白质组学方法，进步阐明ＡｒｃＡ在副猪嗜血杆菌致病过程中的作用和分子机制

6、。具体工作如下：１．构建副猪嗜血杆菌ＥＰ３菌株基因缺失株＂－２８ａ－２８ａ质粒构建了ＥＴｆｌｒｃ／ｉ表达载体．＜ＢＬ２１用ｐＥＴｐ，转入大肠杆菌￡：〇／／中进。以包涵体形式可大量表达ＡｒｃＡ蛋白。行诱导表达对表达条件进行了优化，该载体融合蛋白经纯化后免疫小鼠，制备多克隆抗体，获得相应ＡｒｃＡ蛋白的抗血清。选择“”ＡＤｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢ自杀质粒构建基因缺失株。利用自然转化方法，构建了质粒ｐ，转化ＨＰＳＥＰ３菌株后，获得ＨＰＳ／ＷｒＪ缺失株。构建了ＨＰＳ基因单拷贝的互补质ＡＡｗｄ缺失株－ＡａｒｄＡ。通过ＰＣＲ粒ｐＣ，将质粒ｐＣ转化到

7、后，获得其互补菌株Ｃｅｓｔｅｒｎ－ｂ３ｄ基因检测、ｗｌｏｔｉｎｇ和基因测序进行鉴定，证实ＨＰＳＥＰ菌株ａｒ缺失株构建成功。２－．副猪嗜血杆菌野毒株ＥＰ３株、和互补株ＣＡｗｄ生物学特性研究通过生长特性的测定，发现在厌氧条件下Ａａｒｄ缺失株的生长速度明显变慢，互补株生长速度和野毒株一样；但是在有氧条件下，缺失株的生长速度没有明显变化，说明了在厌氧环境下ＡｒｃＡ调节了ＥＰ３菌株的生长，缺失后导致生长缓慢。在抵抗血清中补体杀菌作用方面，ＥＰ３株具有很高的抵抗血清杀菌的能力；但是ＡｒｃＡ的缺失