三种伯氏疟原虫传播阻断疫苗候选抗原截短片段的筛选及其传播阻断效应的研究

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1、+分类号：R382.31单位代码：10159密级：公开学号：201520062硕士学位论文中文题目：三种伯氏疟原虫传播阻断疫苗候选抗原截短片段的筛选及其传播阻断效应的研究ScreenintheTruncatedFragmentsofThreeTransmission-blocking英文题目：VaccineCandidateAntigensfromplasmodiumbergheiandStudyofTheirBlockingEffects论文作者：焦海晶指导教师：罗恩杰教授学科专业：病原生物学完成时间：2018年3月中国医科大学硕士学位论文三种伯氏

2、疟原虫传播阻断疫苗候选抗原截短片段的筛选及其传播阻断效应的研究ScreeningtheTruncatedFragmentsofThreeTransmission-blockingVaccineCandidateAntigensFromPlasmodiumBergheiandStudyofTheirBlockingEffects论文作者焦海晶指导教师罗恩杰教授申请学位医学硕士培养单位基础医学院一级学科基础医学二级学科病原生物学研究方向抗疟原虫感染免疫论文起止时间2015年12月—2018年3月论文完成时间2018年3月中国医科大学（辽宁）2018年3月

3、I中国医科大学硕士学位论文摘要目的：疟疾是以按蚊为传播媒介的传染病，可以引起严重的并发症甚至死亡。仅2016年全世界就有2.16亿疟疾新增病例和44.5万例死亡病例的报道。尽管通过扩大性干预措施，包括以青蒿素为基础的联合疗法（ACTs）,蚊帐和杀虫剂的使用等多种手段的联合应用使得疟疾的患病率和死亡率大幅度下降。但耐青蒿素恶性疟原虫在东南亚的出现及迅速传播、按蚊抗药能力的增强及疫苗的缺乏，对疟疾的治疗和防控构成了巨大威胁。针对疟原虫的生活史所研制的抗疟疾疫苗主要分三大类：红前期疫苗与红内期疫苗以及传播阻断疫苗（TransmissionBlockingV

4、accines,TBVs）。红前期与红内期疫苗能有效地降低疟疾的感染率与临床中发病率，但它们的候选抗原都暴露在宿主的免疫环境之下，受宿主免疫压力等诸多因素影响，所以其前景并不如预期乐观。TBVs的抗原主要表达于疟原虫的有性阶段，这类抗原并不在宿主免疫系统的选择压力之下，所以表现出非常低的多态性水平，不易出现抗原的变异，更有利于稳定疫苗的免疫效果，因而成为当前疟疾疫苗研究的热点。值得注意的是，TBVs并不能保护疫苗接种者免于感染疟疾，但是有助于预防疾病的传播。TBVs已经被证明是有效的减少疟疾传播的方法。但迄今为止仅有少量的TBVs候选抗原的功能被证实

5、。人们迫切需要开发出安全高效的新型抗原。经过我们前期的研究发现，伯氏疟原虫有性阶段抗原PSOP25（PBANKA_111920），PbQSOX（PBANKA_145540），PSOP26（PBANKA_145770）是高度保守的疟原虫蛋白。PSOP25和PSOP26和pbQSOX是表达于疟原虫动合子阶段的特定蛋白，三者均具有一定的传播阻断效应。我们通过对其进行生物学分析，适当截取优势片段表达重组蛋白，观察新的截短蛋白能否保留原有的生物学功能。以期为进一步研制TBV复合疫苗提供实验依据，奠定基础。研究方法1.三种候选抗原的选择及其生物信息学分析选取疟原

6、虫数据库plasmoDB中功能未知的基因,基因号分别为PBANKA_111920（PSOP25）,PBANKA_145540(pbQSOX),PBANKA_145770(PSOP26),III中国医科大学硕士学位论文应用相关生物信息学软件进行分析,排除信号肽等低复杂区域，选取抗原决定簇较高，能够分泌到细胞外且具有高度同源性的功能域为目的基因，以便更高效合成蛋白。2.获取目的基因及构建原核表达载体小鼠感染疟原虫后当疟疾血症达到50%时，麻醉后心脏采血采集小鼠血液，提取疟原虫基因组DNA。以此为模板进行PCR，分别扩增三段目的基因。验证正确后克隆入原核表

7、达载体pET32a(+)中，酶切及测序验证。3.重组蛋白的表达与纯化将测序正确的原核表达载体转化到大肠杆菌RGB中增菌，加入IPTG诱导表达重组蛋白。经SDS-PAGE电泳检测蛋白表达的情况，验证正确后大量表达收集，纯化。采用BCA的方法检测蛋白浓度。4.实验动物免疫及血清采集6-8周雌性BALB/c小鼠28只，随机分为PSOP25组，pbQSOX组，PSOP26组和PBS对照组(n=7)。分别免疫三组重组蛋白和PBS。每两周免疫一次，共免疫三次，于每次免疫前一天与最后一次免疫后第10天收集每只小鼠血液，室温凝集后收集血清。5.重组蛋白的免疫活性检测

8、采用ELISA方法，分别以三种重组蛋白为抗原包被96孔板，1：3200稀释免疫血清作为一抗，1：5000稀释