h9流感抗原性及免疫原性分析20120222

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1、第一章引言1流感概述流感病毒（influenzavirus）属于正粘病毒科（Orthomyxoviridae），流感病毒属，具有囊膜的分节段负链RNA病毒。病毒内部由单链核糖核酸和核蛋白组成，根据核蛋白(NP)和基质蛋白（M）的抗原性不同，分为A、B和C三种类型，它们之间的抗原差异可以通过可以通过琼脂扩散试验验证。三种类型的病毒由于在结构方面存在较大差异，致病性方面也有不同。1.1第二章27株流感病毒的免疫原性分析1材料与方法1.1病毒分离株27株H9N2流感病毒分离株均由上海兽医研究所流感实验室鉴定并保

2、存。病毒具体信息见表1表127株H9N2流感病毒分离表采样地点病毒名称采样地点病毒名称上海Ck-Shanghai-1-06广东Ck-Guangdong-1214-09Ck-Shanghai-2-04Ck-Guangdong-1258-09Ck-Shanghai-4-06Ck-Guangdong-1351-09Ck-Shanghai-5-03Ck-Guangdong-1494-09Ck-Shanghai-6-03Ck-Guangdong-1683-09Ck-Shanghai-50-09江苏Ck-Jiangs

3、u-825-09Ck-Shanghai-96-09Ck-Jiangsu-925-09Ck-Shanghai-169-09湖南Ck-Hunan-2106-09Ck-Shanghai-340-09Ck-Hunan-2230-09Ck-Shanghai-441-09Ck-Hunan-2351-09Ck-Shanghai-510-09山东Ck-Shandong-2552-09安徽Ck-Anhu-1-10Ck-Shandong-2567-09吉林Ck-Jilin-3-09福建Dk-Fujian-1753-09F株V

4、accine1.2SPF鸡胚和SPF鸡SPF鸡胚购自北京梅里亚公司，SPF鸡饲养于负压隔离其中。1.3H9N2流感病毒的鉴定血清学鉴定：流感病毒分离阳性血清H3、H4、H5、H9和H10标准阳性血清由本实验室制备并保存。PCR鉴定：在所收集的尿囊液有血凝，而不能和标准阳性血清进行中和反应的毒株，分别提取尿囊液RNA，反转录形成cDNA后用流感病毒的PCR方法进行鉴定。1.4H9N2流感病毒的有限稀释法纯化及EID50测定实验用27株H9流感病毒分别应用有限稀释法进行纯化，方法：吸取病毒尿囊液50μl加入到

5、含青霉素1000U/ml，链霉素1000U/ml的450μlPBS中，依次进行10倍比稀释，然后以不同稀释倍数的病毒液接种9～11日龄SPF鸡胚，每枚100μl，平行3胚。接毒后鸡胚继续孵化箱中孵育48h后测定血凝，收取并保存最高稀释倍数具有最高血凝价的鸡胚尿囊液，用于下一轮纯化。如此连续经过3次纯化后，把最后收取的尿囊液105稀释，再次以100μl接毒SPF鸡胚，48h收取尿囊液，混匀后分装-80℃保存，分装的H9病毒液经鉴定无污染后用于后续实验。为防止传代过程中H9流感病毒传代丢失及出现杂病毒的情况，

6、实验中对每一次收取的尿囊液进行了血凝学及PCR鉴定，准确无误后用于下一轮纯化。EID50测定：吸取分装病毒尿囊液50μl加入到含青霉素1000U/ml，链霉素1000U/ml的450μlPBS中，依次进行10倍比稀释，然后以不同稀释倍数的病毒液接种9～11日龄SPF鸡胚，每枚100μl，平行3胚。接毒后鸡胚继续孵化箱中孵育48h后测定血凝，根据Reed-Muench方法计算EID50结果。1.5H9N2流感病毒血清的制备选择经纯化的25株H9N2流感病尿囊液，以终浓度0.3%甲醛灭活24h，然后以3：7的

7、关系和疫苗用油乳剂剧烈震荡混合制作灭活疫苗。经滴水检验合格后，以0.5ml/只颈部皮下免疫4周龄SPF鸡。第21天颈部处死所有SPF免疫鸡，收集血清，分装后于-20℃保存。1.7H9N2流感病毒血凝抑制实验用25株H9N2流感病毒和25种制备的对应阳性血清分别交叉进行血凝抑制反应。实验用体积浓度为0.5%的红细胞，配制的病毒抗原为8～16单位。此实验重复两次。1.8代表抗原性差别“r”值的计算“r”值计算方法参照《动物病毒学》第二版第723页，“r”值代表两毒株之间的抗原差异，等于1表示两毒株抗原性相同，

8、随着值的增加两毒株的差异愈大，亦抗原的相关性愈小，当值大于4时，表示两毒株抗原差异性显著。1.9H9N2流感病毒中和实验测定27株H9N2流感病毒HA基因序列，对1683bp长度的开放阅读进行遗传进化树分析后，选取各分支中的11株病毒进行鸡胚中和实验。病毒配制：在无菌条件下，用4℃保存的含有青霉素1000U/ml，链霉素1000U/ml的PBS分别稀释11株流感病毒，使病毒含量为100EID50/100μl，冰上保存。血清配制