SNT1166.2-2002水泡性口炎微量血清中和试验操作规程.pdf

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1、SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNIT1166.2-2002水泡性口炎微量血清中和试验操作规程Protocolofmicro-serumneutralizationtestforvesicularstomatitis2002一11一25发布2003一05一01实施中华人民共和国。*国家质量监督检验检疫总局认-Il.SN/T1166.2-2002oli胃水泡性口炎(VesicularStomatitis,VS)血清中和试验是在参考国际兽疫局(OIE)Q哺乳动物、禽和蜜蜂A和B类疾病诊断试验和疫苗标准手册》和实

2、践经验的基础上制定。本标准的附录A为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国云南出人境检验检疫局。本标准主要起草人:花群义、周晓黎、徐自忠、杨晶焰。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。SN/T1166.2-2002水泡性口炎微量血清中和试验操作规程范围本标准规定了水泡性口炎病毒中和试验方法。本标准适用于动物水泡性口炎病毒抗体和定型检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版

3、均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682-1992分析实验室用水规格和试验方法(eqvISO3696:1987)缩略语下列缩略语适用于本标准。3.1CPE:致细胞病变作用。3.2TCID,o:半数组织培养感染量。3.3VSV:水泡性口炎病毒。3.4VSV-NJ:水泡性口炎病毒新泽西型;VSV-IND水泡性口炎病毒印地安那型。原理特异性的血清中和抗体与病毒结合后，能够抑制病毒对敏感细胞的吸附，使其失去感染能力，

4、从而阻止病毒在细胞中的复制。这一反应不但表现为一种病毒只能被相应的免疫血清所中和，而且还表现在中和一定量的病毒(感染力)必须有一定效价的免疫血清。中和试验以测定病毒的感染力为基础，必须选用病毒易感的细胞为材料，中和抗体滴度的判定以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据。动物在感染水泡性口炎病毒后4d^-5d即可产生特异性抗体。中和抗体具有高度的型特异性，因此，通过中和试验可进行定型鉴定。5试剂和材料5.1病毒:VSV-NJ和VSV-IND国际标准毒株，由指定单位提供。5.2血清;VSV两型标准阳性血清、阴性血清，

5、由指定单位提供。5.3被检血清:牛、猪血清经60'C30min灭活。马血清经650C30min灭活。5.4细胞:BHK,，或Vero细胞株。5.5培养液:E-MEM细胞生长液，参见附录Ao5.6维持液和稀释液:E-MEM细胞维持液，参见附录A,5.7细胞分散液:参见附录A,5.8水:符合GB/T6682-1992分析实验室二级水规格。器械和设备分析天平、高压灭菌器、干烤箱、超声波粉碎机、倒置显微镜、微型振荡器、二氧化碳培养箱、冰箱(一20℃保存血清，一70℃保存种毒)。96孔组织培养板，单孔道、多孔道微量移液器(20

6、pL-200pL)。SN/T1166.2-2002试验操作方法7.1病毒份殖制备BHKZ，或Ver。细胞单层，加维持液洗去细胞培养液中的犊牛血清后，弃维持液，然后接种VSV-NJ型和VSV-IND病毒，37℃吸附1h，弃去细胞瓶中接种的病毒液，加人维持液，置5%二氧化碳培养箱37℃培养，逐日观察。待CPE达75%以上，收获病毒悬液，冻融或超声波处理，2000r/min离心20min，分装成每小瓶1ml，置一70℃保存备用。7.2毒价测定将各型病毒在96孔板上作lo'-10-1,稀释，每孔病毒悬液为25川，每个稀释度作

7、八孔，加人100pL细胞悬液(浓度3X10，细胞/MI.)，每块板设八孔细胞对照。置5%二氧化碳培养箱37'C培养，从24h开始逐日观察记录CPE。按Karber方法计算出各型病毒的TCID,n/25pL,7.3操作步骤7.3.1被检血清，用E-MEM做倍比系列稀释。7.3.2VSV-IND和VSV-NJ标准阳性血清，经560C30min灭活，并用E-MEM做1:4-1:512稀释。7.3.3阴性血清对照:阴性血清对照无需单独做，VSV-IND和VSV-NJ标准阳性血清互为阴性血清对照。7.3.4工作病毒液的制备:用

8、96孔细胞板滴定各型VSV的滴度，配制成100TCID,o/25yL,7.3.5BHK,或Ver。细胞悬液的制备:用细胞培养瓶培养BHKZ，或Ver。细胞，长满单层，倒出培养液，加无钙、镁离子的PBS冲洗两次，加消化液，轻轻摇晃片刻后倒出，留1mL-v2ml于37℃消化2min-3min，当细胞完全脱落后，加E-MEM细胞生长液，吹打均匀后，用