SNT1559-2010非洲猪瘟检疫技术规范.pdf

《SNT1559-2010非洲猪瘟检疫技术规范.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１５５９—２０１０代替ＳＮ／Ｔ１５５９．１—２００５、ＳＮ／Ｔ１５５９．２—２００５、ＳＮ／Ｔ１５５９．３—２００５非洲猪瘟检疫技术规范犘狉狅狋狅犮狅犾狅犳狇狌犪狉犪狀狋犻狀犲犳狅狉犃犳狉犻犮犪狀狊狑犻狀犲犳犲狏犲狉２０１００３０２发布２０１００９１６实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜１５５９—２０１０前言本标准代替ＳＮ／Ｔ１５５９．１—２００５《非洲猪瘟直接免疫荧光试验操作规程》、ＳＮ／Ｔ１５５９．２—２００５《非洲猪瘟间接免疫荧光试验操作规程》、ＳＮ／Ｔ１５５９．３—２００５《非洲猪瘟病毒红血球吸附试验

2、操作规程》。本标准的附录Ｂ为规范性附录，附录Ａ、附录Ｃ、附录Ｄ和附录Ｅ为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人：罗宝正、潘文波、林祥梅、曾少灵、薄清如、吴绍强、徐海聂、杨素。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ标准分享网www.bzfxw.com免费下载犛犖／犜１５５９—２０１０非洲猪瘟检疫技术规范１范围本标准规定了非洲猪瘟红细胞吸附试验、荧光抗体试验、聚合酶链式反应和犜犪狇ｍａｎ探针荧光ＰＣＲ、酶联免疫吸附试验、间接荧光抗

3、体试验和免疫印迹试验的技术要求。本标准适用于非洲猪瘟的检疫。２规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ１９４８９实验室生物安全通用要求３缩略语下列缩略语适用于本标准。３．１ＡＳＦ：非洲猪瘟。３．２ＡＳＦＶ：非洲猪瘟病毒。３．３ＨＡＤ：红细胞吸附。３．４ＦＡＴ：荧光抗体试验。３．５ＰＣＲ：聚合酶炼反应。３．６ＥＬＩＳＡ：酶联免疫吸附试验。３．７ＩＦＡＴ：间接

4、免疫荧光抗体试验。３．８ＭＥＭ：最低基础培养基。３．９ＰＢＳ：磷酸缓冲溶液。３．１０ＥＤＴＡ：乙二胺四乙酸。３．１１ＣＰＥ：细胞病变效应。３．１２ｄＮＴＰ：脱氧核糖三磷酸。１犛犖／犜１５５９—２０１０３．１３ＤＮＡ：脱氧核糖核酸。３．１４Ｃｔ：循环阈值。３．１５ＦＩＴＣ：异硫氰酸荧光素。４初步诊断参照附录Ａ中的临床症状和病理变化做出初步诊断，确诊还需实验室诊断。实验室诊断方法见第５章至第１１章。５病毒红细胞吸附试验（犎犃犇）５．１材料５．１．１０．９％氯化钠：配制方法见附录Ｂ。５．１．２０．０１ｍｏｌ／ＬｐＨ７．４ＰＢＳ：配制方法见附录Ｂ。５．１．３青霉素、链霉素、庆大霉素和制

5、霉菌素。使用前用上述ＰＢＳ分别配成１００００ＩＵ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、５００ＩＵ／ｍＬ和５００ＩＵ／ｍＬ的溶液。５．１．４肝素：使用前用０．９％氯化钠配成１０００ＩＵ／ｍＬ。５．１．５细胞基础培养液：配制方法见附录Ｂ。５．１．６１％猪红血胞：配制方法见附录Ｂ。５．１．７非洲猪瘟标准毒株www.bzfxw.com。试验环境和防护要求见ＧＢ１９４８９，以下病毒操作的过程都按此要求。５．１．８待检样品：包括肝素（或ＥＤＴＡ）抗凝血和脾脏、扁桃体、肾脏、淋巴结等组织。被检样品在运输过程中应尽可能的低温保存，但不能使样品冻结。样品到达实验室之后，如果不是立刻用于诊断，应该保存在－７０℃

6、冰箱。５．２操作方法５．２．１制备组织悬液在放有灭菌砂子的研钵中，用组织研磨器或捣碎器将被检组织磨碎，加入５ｍＬ～１０ｍＬ含抗生素的ＰＢＳ（ｐＨ７．４），制成组织悬液（每毫升组织悬液的抗菌素含量为：青霉素１０００ＩＵ，链霉素１ｍｇ，庆大霉素５０ＩＵ和制霉菌素５０ＩＵ）。将组织悬液１０００犵离心５ｍｉｎ，取上清保存在４℃备用。５．２．２制备白细胞采取健康猪血，用玻璃珠脱纤或用肝素抗凝（每毫升猪血含肝素１００ＩＵ），７００犵离心３０ｍｉｎ，将上层血清或血浆吸出备用。吸取中间淡黄色白细胞层，加三倍体积的０．８３％氯化铵溶液，混合后室温孵育１５ｍｉｎ，６５０犵离心１５ｍｉｎ，小心转移上

7、清液，剩下的细胞沉淀用细胞基础培养液或ＰＢＳ洗涤３次，备用。５．２．３制备细胞培养液将上述血清或血浆加入细胞基础培养液内配制成细胞培养液，血清或血浆的终浓度为１０％～３０％，同时加入抗生素。５．２．４培养白细胞将白细胞悬浮于细胞培养液中，使细胞含量为１０６个／ｍＬ～１０７个／ｍＬ，分装于１６０ｍｍ×１６ｍｍ的管中，每管１．５ｍＬ，将试管与水平面呈５°～１０°倾斜放置，置于５％二氧化碳环境中，３７°培养２ｄ～６细胞／ｍＬ～１０７细４ｄ。这一过程也可以在９６孔培养板上进行，每孔加入２００μＬ白细