利用脱细胞猪角膜基质构建组织工程化兔板层角膜的实验研究

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1、中山大学硕士学位论文利用脱细胞猪角膜基质构建组织工程化兔板层角膜的实验研究姓名：段豪云申请学位级别：硕士专业：干细胞与组织工程指导教师：王智崇20100519中山大学硕士学位论文利用脱细胞猪角膜基质构建组织工程化兔板层角膜的实验研究利用脱细胞猪角膜基质构建组织工程化兔板层角膜的实验研究专业：干细胞与组织工程硕士研究生：段豪云导师：王智崇教授中文摘要角膜是位于眼表的透明组织，具有屏障外界刺激和屈光等重要功能，包括5层结构：复层角膜上皮，前弹力层，角膜基质层，后弹力层，单层内皮细胞。严重、持续的角膜损伤会造成角膜溃疡，穿孔，瘢痕形成，最终影响视功能。目前角膜病已成为全球第二大致

2、盲眼病。作为可逆性盲，角膜移植是治疗角膜盲的主要手段。在我国，由于移植材料的来源匮乏，每年能够进行的角膜移植手术远远不能满足临床几百万例的等待需求，组织工程化角膜是解决这一问题的有效途径。目前组织工程角膜的研究因所选用支架材料的不同，构建的角膜替代物有着不同的表现。以合成材料作为支架材料所构建的组织工程角膜，由于材料本身不能完全模拟天然细胞外基质的结构和成分，往往在生物力学、光学性能以及生物学特性等方面存在不同程度的不足。而异种角膜是一种良好的角膜支架材料来源，本实验室所开发的脱细胞猪角膜基质(Acellularporcinecorneastroma,APCS)在前期研究证

3、实其具有足够的生物力学强度，高度的透明性；角膜基质天然结构和细胞外基质成分的保留使其具有良好的生物学特性，能够满足组织工程角膜构建的要求。因此本课题：一I一中山大学硕士学位论文利用脱细胞猪角膜基质构建组织工程化兔板层角膜的实验研究目的利用自行研制的脱细胞猪角膜基质作为支架材料，体外构建组织工程化的兔板层角膜。方法1．制备角膜构建需要的支架材料，并对其进行HE染色以检测脱细胞情况，利用蛋白多糖检测试剂盒鉴定脱细胞猪角膜基质中氨基葡聚糖的含量；并检测脱细胞猪角膜基质在2小时内的吸水率。2．取新西兰大白兔颢上象限角膜缘小组织块，种植在经表皮生长因子(epidermalgrowth

4、factor,EGF)复水的脱细胞猪角膜基质片上，使用自行研制的干燥装置进行体外培养。在培养的第l、2、3周取材时对构建的板层角膜表层细胞形态进行倒置相差显微镜的观察，取到的板层角膜进行石蜡包埋后HE染色观察板层角膜的组织结构：通过透射电镜对板层角膜的复层上皮细胞间以及细胞与基质问的连接情况进行检查，免疫荧光染色检测板层角膜基底膜组分纤维连接蛋白和层粘连蛋白的形成情况。结果1．对脱细胞猪角膜基质进行HE染色结果显示，经过脱细胞处理的猪角膜基质中未见到任何完整细胞或细胞碎片，胶原板层结构未破坏。蛋白多糖定量分析，脱细胞猪角膜基质较正常角膜在脱细胞过程中丢失了20％左右的氨基葡

5、聚糖，但是在吸水率检测中，2小时内脱细胞猪角膜基质仍可恢复至正常含水量。2．使用角膜缘小组织块构建正常含水量板层角膜。倒置相差显微镜下可见到其表层上皮细胞在培养过程中呈典型的“铺路石”样外观。组织学及超微结构均显示角膜上皮细胞在支架材料上能够良好黏附，生长，增殖，迁移并分化，所形成的复层结构类似于天然角膜上皮细胞的极性分布；同时，透射电镜结果显示中山大学硕士学位论文利用脱细胞猪角膜基质构建组织工程化兔板层角膜的实验研究细胞——细胞问和细胞——细胞外基质问连接形成，可见到成熟的紧密连接，半桥粒等结构。免疫荧光显示构建的板层角膜，基底膜组分纤维连接蛋白和层粘连蛋白的表达阳性。结

6、论以脱细胞猪角膜基质为支架材料所构建的兔板层角膜，在结构上与天然角膜类似，具有较好的生物学表现。关键词组织工程；角膜；脱细胞基质；正常含水量中山大学硕士学位论文利用脱细胞猪角膜基质构建组织工程化兔板层角膜的实验研究Reconstructionofarabbitcorneawithlll●l··lacellUlarDorclnecornealstromaastllescaffoldMajor：stemcellandtissueengineeringName：HaoyunDuanSupervisor：Prof．ZhichongWangAbstractCorneaisatrans

7、prentmembraneinthefrontoftheeye．Thecorneaisaprotectiveandrefrectivemembranewhichlightrayspassthroughtotheretina．Thecorneaconsistsoffivelayers：theoutermostepithelium，thebowman’Slayer,thestroma,thedescemet’Smembrane，andtheinnermostendothelialcelllayer．Anydamaget