力学负荷对体外培养软骨细胞及在体软骨的影响

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1、华中科技大学博士学位论文力学负荷对体外培养软骨细胞及在体软骨的影响姓名：李凯申请学位级别：博士专业：外科学（骨外）指导教师：杨述华;卫小春20090401华中科技大学博士学位论文摘要第一部分力学因素对体外培养兔软骨细胞糖胺多糖合成的影响实验一原代和传代兔关节软骨细胞糖胺多糖合成的动态观察目的研究传代对体外培养兔关节软骨细胞糖胺多糖（glycosaminoglycan，GAG）合成的影响。方法1月龄新西兰兔5只，无菌手术切取双膝关节软骨，采用0.4%Pronase酶和0.025%II型胶原酶消化分离关节软

2、骨细胞，体外培养。待细胞融合时，换无血清培养液。于换液后12、24、36、48、60h分别抽取上清液测量GAG浓度。传代两次，重复上述过程。采用重复测量资料的方差分析检验P0、P1、P2代细胞上清液液GAG浓度的差异。结果P2代以内，软骨细胞形态无明显变化，但P2代细胞内空泡状颗粒增多。传代后，细胞融合时间缩短，但是上清液GAG浓度随传代逐渐下降（P<0.001）,且P0、P1、P2代之间两两比较差异有显著性（P<0.001）。换液60h后，P1代软骨细胞GAG浓度较P0代下降24%，P2代较P0代下降

3、74%。换液后时间越长，上清液GAG浓度越大（P<0.001）。换液后时间与传代之间存在交互效应，时间越长，传代细胞与原代细胞上清液GAG浓度相差越大（P<0.001）。结论在体外单层培养条件下，原代软骨细胞GAG合成能力最强，传代后很快大幅下降。细胞融合后连续检测上清液GAG浓度是研究软骨细胞分化的有效方法。关键词软骨细胞；传代；糖胺多糖；兔实验二高密度细胞培养对兔关节软骨细胞糖胺多糖合成的作用目的观察不同接种密度下，软骨细胞合成糖胺多糖的能力。材料与方法1月龄新西兰兔5只。采用0.4%Pronase

4、酶和0.025%II型胶原酶消2华中科技大学博士学位论文化分离双膝关节关节软骨细胞，来源于同一只兔的软骨细胞分为两部分，一部分以2×104/cm2接种，传代时仍以相同密度接种。另一部分在细胞贴壁后,人工降低细胞密度至2×103/cm2培养。倒置显微镜下观察细胞形态和增殖情况。原代和传1代细胞于细胞融合后换液。换液后12，24，36，48，60h以改良Alcianblue染色沉淀法测定糖胺多糖质量浓度。结果原代高密度培养组关节软骨细胞为多边形,轮廓清晰，三四天即可见集落形成，集落周边细胞较中心瘦长，为长多

5、边形，传1代细胞形态无明显变化。低密度培养细胞早期散在分布，7d左右形成集落，细胞形态与高密度培养无明显差异。原代低密度培养软骨细胞长到融合所需时间较原代高密度培养细胞所需时间长。原代低密度培养组上清液中糖胺多糖质量浓度显著低于原代及传1代高密度培养组软骨细胞（P<0.001，P<0.05），且时间越长，质量浓度相差越大。结论与低密度培养相比，平面高密度培养可提高软骨细胞合成糖胺多糖的能力，明显减缓软骨细胞的失分化速度，提示高密度培养更有利于软骨细胞维持表型，是软骨平面培养的较好方式。关键词软骨细胞；传

6、代；糖胺多糖；兔；关节软骨实验三不同强度循环拉伸对原代培养兔软骨细胞糖胺多糖合成的影响目的研究不同强度的循环动态拉伸（Cyclictenislestrain，CTS）对原代培养的兔关节软骨细胞糖胺多糖（glycosaminoglycan，GAG）合成的影响。方法1月龄新西兰兔6只，无菌手术切取双膝关节软骨，采用0.4%Pronase酶和0.025%II型胶原酶消化分离关节软骨细胞，来源于同一只兔的软骨细胞分为3部分，分别接种3块BioFlex培养板，通过Flexercell4000系统分别给予正弦波形、

7、0.3Hz、6h/d,强度分别为0%、5%、15%的CTS刺激。于加载后24、36、48、60h观察细胞形态，并分别抽取上清测量GAG浓度。采用重复测量资料的方差分析比较不同强度CTS刺激组上清液GAG浓度的差异。结果细胞力学加载后可见周边部软骨细胞由多角形变为纺锤形，沿培养皿半径垂直方向排列。随拉伸强度的增加，上清GAG浓度依次上升（P<0.001）,且经两两比较有3华中科技大学博士学位论文显著性差异（P<0.05）。随时间增加，上清GAG浓度逐渐增加（P<0.001）。时间与加载条件之间存在交互效应

8、，时间越长，加载组与对照组上清GAG浓度相差越大（P<0.001）结论CTS可促进单层贴壁关节软骨细胞合成GAG，作用效果随拉伸强度增大而增加。关键词软骨细胞；循环动态拉伸；糖胺多糖；兔；关节软骨第二部分大鼠膝关节负重与非负重区软骨组织学对比分析目的观察大鼠膝关节软骨负重区与非负重区组织形态、基质蛋白多糖成分和II型胶原分布差异。方法Wistar大鼠5只，切取双膝关节，固定，脱钙，包埋，沿矢状面整体切片，HE染色，PH值1.0和2.5阿尔新