SNT2653-2010木瓜中转基因成分定性PCR检测方法.pdf

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1、版权所有·禁止翻制、电子发售中华人民共和国出入境检验检疫行业标准!"!#!"#$"!%&%木瓜中转基因成分定性$%&检测方法$'()(*(+(,)-./01+2)1)23.4(+56.'17.*-128'.1*)2(8!$%&",('9.).*)28::.8.)2*1++56(92,2.9*(64(8.8)28414151!%&%;&&;%&发布!%&&;%#;%&实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局犛犖／犜２６５３—２０１０版权所有·禁止翻制、电子发售前言本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标

2、准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：陈红运、陈双雅、梁新苗、康林、叶正清、李玲、朱水芳、陈洪俊。Ⅰ犛犖／犜２６５３—２０１０版权所有·禁止翻制、电子发售木瓜中转基因成分定性犘犆犚检测方法１范围本标准规定了木瓜中转基因成分的定性ＰＣＲ检测方法。本标准适用于抗病毒转基因木瓜的定性检测。２规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于

3、本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２分析实验室用水规格和实验方法ＳＮ／Ｔ１１９３基因检验实验室技术要求ＳＮ／Ｔ１１９４植物及其产品转基因成分检测抽样和制样方法３缩略语下列缩略语适用于本文件。ＣＰ（ｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅ）：外壳蛋白基因ＣａＭＶ３５Ｓ（３５Ｓｐｒｏｍｏｔｅｒｆｒｏｍｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ）：来自于花椰菜花叶病毒的３５Ｓ启动子ＧＭＹＫ：ＰＲＳＶＹＫ株系ＣＰ基因介导的抗病毒转基因木瓜品系ＮＰＴＩＩ（ｎｅｏｍｙｃｉｎ３′ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｇｅｎｅ）：新霉素３’磷酸转移酶基因ＮＯＳ（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｏｆｎｏｐａｌ

4、ｉｎｅｓｙｎｔｈａｓｅｇｅｎｅ）：胭脂碱合成酶基因终止子ＰＲＳＶ（Ｐａｐａｙａｒｉｎｇｓｐｏｔｖｉｒｕｓ）：木瓜环斑病毒Ｐａｐａｉｎ：木瓜蛋白酶基因，木瓜内源基因Ｒｅｐ（ｒｅｐｌｉｃａｓｅｇｅｎｅ）：复制酶基因５５１／６３１：ＰＲＳＶＨＡ５１株系ＣＰ基因介导的抗病毒转基因木瓜品系华农１号：ＰＲＳＶＲｅｐ基因介导的抗病毒转基因木瓜品系４原理样品经过提取ＤＮＡ后，针对转基因植物所插入的外源基因的基因序列设计引物，通过ＰＣＲ技术，特异性扩增外源基因的ＤＮＡ片断，根据ＰＣＲ扩增结果，判断该样品中是否含有转基因成分。５试剂和仪器５．１试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯

5、或生化试剂。水为ＧＢ／Ｔ６６８２规定的一级水。５．１．１１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ·ＨＣｌ缓冲液（ｐＨ８．０）：称取１２１．１ｇＴｒｉｓ，溶于８００ｍＬ水中，搅拌，加入浓盐酸４２ｍＬ，冷却至室温，用稀盐酸准确调整ｐＨ至８．０，然后定容至１Ｌ，分装后高压灭菌备用。１犛犖／犜２６５３—２０１０版权所有·禁止翻制、电子发售５．１．２０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）：在８００ｍＬ水中加入１８６．１ｇＮａ２ＥＤＴＡ·２Ｈ２Ｏ，在磁力搅拌器剧烈搅拌，用氢氧化钠调节溶液ｐＨ值至８．０（约需２０ｇ氢氧化钠颗粒），然后定容至１Ｌ。分装后高压灭菌备用。５．１．３ＤＮＡ提取缓冲液：量取

6、１００ｍＬ１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＣｌ，５０ｍＬ０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，称取５．０ｇ十二烷基碳酸钠（ＳＤＳ），１６．８４８ｇ氯化钠，定容至１Ｌ，分装灭菌备用。５．１．４ＲＮＡ酶（１０μｇ／ｍＬ）。５．１．５聚乙烯吡咯烷酮（ＰＶＰ）。５．１．６Ｔｒｉｓ饱和酚。５．１．７三氯甲烷。５．１．８异戊醇。５．１．９异丙醇。５．１．１０７０％乙醇。５．１．１１ＴＥ缓冲液：分别加入１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）１０ｍＬ和０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）溶液２ｍＬ，定容至１Ｌ。在１０３．４ｋＰａ（１２１℃）条件下灭菌２０ｍｉｎ。５．１．１２犜犪狇ＤＮＡ聚合酶。５．

7、１．１３ｄＮＴＰ：ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ。５．１．１４５×ＴＢＥ缓冲液：Ｔｒｉｓ５４ｇ，硼酸２７５ｇ，０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）２０ｍＬ，定容至１Ｌ。５．１．１５琼脂糖（电泳纯）。５．１．１６ＤＮＡ分子量标记（１００ｂｐＬａｄｄｅｒ）。５．１．１７溴化乙锭（ＥＢ）或其他染色剂。５．１．１８引物：检测转基因木瓜内、外源基因的引物及其信息见表１。表１检测转基因木瓜内、外源基因所需的引物信息扩增长度检测基因来源引物序列（上游／下游）提示备注ｂｐ５’ｔｇｃｔｔｇａｃｔｇｃｇａｃａｇａｃ３’Ｐａｐａｉｎ内源１４４木瓜内源基因５’ｃｔｔｔｃ