产甲壳素酶菌株的发酵条件、酶的分离纯化及酶学性质研究

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1、万方数据第40卷第10期2010年lO月中国海洋大学学报PERIoDICAL()F0CEANUNIVERSITYoFCHINA40(i0)：057～062Oct．。2010产甲壳素酶菌株的发酵条件、酶的分离纯化及酶学性质研究韩宝芹1，伊金玲1，蔡文娣2，杨艳1，董文1，刘万顺1(1．中国海洋大学海洋生命学院，山东青岛266003；2．潍坊医学院，山东潍坊261042)摘要：利用甲壳素为唯一碳源从土壤中筛选得到1株产甲壳素酶活力较高的菌株HD002，初步鉴定其为Massilia属。确定菌株产甲壳素酶的最适培养基组成为(g

2、／L)：(NHn)2S045，K2HP040．7，KHzP040．3，MgS(h·7H201，胶体甲壳素10；最适产酶堵养条件为：培养基起始pH值6．0，培养时问192h，发酵液酶活力达1．314u／mL。采用70％饱和度硫酸铵盐析、DEAE-SepharoseF．F阴离子交换层析、Sephadex@75凝胶过滤层析对该甲壳素酶进行纯化，SDSPAGE证明达到电泳纯。该甲壳素酶的分子母为60．2kDa，最适反应温度为55℃，最适反应pH值为5．0，Cu2+和F一+对酶活力有明显的抑制作用，Ca2十和Na’对酶活力有明显

3、的促进作用。关键词：甲壳素酶；发酵条件；分离纯化；酶学性质中图法分类号：Q555文献标志码：A文章编号：1672—5174(2010)10—057—07甲壳素是地球上除纤维素外数量最大的大然高分子多糖，亦是地球卜除蛋白质外数量最大的天然含氮有机化合物，广泛存在于虾、蟹、昆虫等的甲壳以及真菌和植物的细胞壁中[1]。甲壳素的降解产物——几丁寡糖是1种功能性寡糖，具有抑菌、抗肿瘤、保湿、提高植物防御力等功能[2。5j，已被广泛应用到各个领域。通过化学法降解甲壳素制备几丁寡糖反应条件苛刻，稳定性差，副产物多，环境污染严重；而酶

4、法降解甲壳素反应条件温和，稳定性好，产物均一，无污染。因此，酶法降解甲壳素具有非常好的应用前景。目前，酶法降解甲壳素面临的最大困难是，甲壳素酶活力低，生产周期长，成本高，不能大规模应用。因此，筛选得到产甲壳素酶活力高的菌株具有重要的研究意义。本文从海边土壤取样，筛选了1株产甲壳素酶活力较高的菌株，在进行了菌株的初步鉴定基础上，对发酵条件进行了优化，并对分离纯化的甲壳素酶进行了酶学性质研究。1材料和方法1．1材料1．1．1供试菌株从海边土壤筛选得到，菌株编号HD002。1．1．2发酵培养基组成(g／L)(NI-h)2s0

5、45，K2HP040．7，KH2P040．3，MgS04·7H201，胶体甲壳素10，调整pH=6．0。1．1．3胶体甲壳素将200mI。H2S()。溶液(50％浓收稿只期：2010—04—07；修订口期；2010—05—12作者简介：韩宝芹(1963一)，女，教授。E-mail：baoqinh@OUC．edu．cn度)缓缓加入盛有20g甲壳素粉末的烧杯中，迅速搅拌，30min后，缓慢加入约1500mI。自来水，不断搅拌，然后分装到500mL离心杯中，4000r／min离心15min，将上清液倒出，向沉淀中加入自来水重

6、新悬浮，反复离心洗涤胶体至pH值中性，再用蒸馏水离心洗涤3次即可，制得的胶体甲壳素放入4℃冰箱保存备用。1．2菌种鉴定I．2．116SrDNA序列测定用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)提取DNA。引物为细菌16SrDNA通用引物：B8F：5，-AGAGTTTGATC—CTGGCTCAC--3’和B1510：5"-GGTTACCTTGT—TACGACTT一3’。PCR体系(50gL)：10Xbuffer(无M矿’)5弘L，25nmol／I。MgCl23弘L，2．5mmol／LdNTP1弘L，Taq5

7、U／mI．0．25弘L，模板1肛L，弓I物l(50tLmol／L)0．5肚I。，引物2(50tlmol／L)0．5弘L，双蒸水38．75肚L。PCR程序：94℃预变性5min，94℃变性lmin，55℃退火1min，72℃延伸lmin30s，30个循环，72℃延伸10min。PCR产物由南京金斯瑞生物科技有限公司测序，然后登陆NCBI网站将测序结果与已有序列进行比对。1．2．2形态和生理生化指标鉴定形态鉴定：通过显微镜观察菌体制片对菌株HD002进行形态特征鉴定。生理牛化指标鉴定：根据该菌株16SrDNA序列的比对结果

8、，将其进行初步定位。然后采用BIOL(好法进行菌株生理生化指标鉴定。在《伯杰氏细菌鉴定手册》第九版L6j查阅与其相似度达99％的种所在科，并万方数据中国海洋大学学报对照比较此科下所有属的生理生化特征，进行菌株鉴定。1．3发酵培养条件的优化将5mL种子液(培养48h)接种于150mI，液体发酵培养基(盛放于500mL锥形瓶)中，培养