紫花苜蓿铝胁迫响应基因MsMATE与MsSTOP1的功能与表达调控研究

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1、紫花苜蓿铝胁迫响应基因MsMATE与MsSTOP1的功能与表达调控研究重庆大学博士学位论文学生姓名：张宝云指导教师：陈国平教授副导师：王凭青教授专业：植物学学科门类：理学重庆大学生物工程学院二〇一七年九月FunctionandExpressionRegulationofAluminum-responsivegenesMsMATEandMsSTOP1inMedicagoSativaAThesisSubmittedtoChongqingUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementfortheDoctor’sDegreeof

2、ScienceByZhangBaoyunSupervisedbyChenGuopingAssistantSupervisedbyWangPingqingSpecialty：BotanyBioengineeringCollegeofChongqingUniversity,Chongqing,China.Sep.2017中文摘要摘要铝毒是酸性土壤中限制农作物生长和产量的重要因素，植物遭受铝离子毒害的典型症状就是根伸长的抑制。很多植物可以通过释放有机酸来螯合活性铝离子，从而缓减铝毒。因此有机酸转运蛋白能够通过增加有机酸的分泌来提高植物对铝胁迫的耐受性。紫花苜蓿（Medic

3、agosativaL.）是一种对铝毒非常敏感的豆科牧草，很难适应我国南方的酸性土壤，严重制约现代畜牧业的发展。探索紫花苜蓿潜在的耐铝机制，培育能够适应酸性土壤的紫花苜蓿新品种对我国苜蓿产业的发展具有重要价值。本研究通过基因芯片杂交、荧光定量PCR、酵母单杂交、凝胶阻滞和拟南芥（Arabidopsisthaliana）突变体回复实验等手段对紫花苜蓿铝胁迫响应基因MsMATE和MsSTOP1进行了系统研究，主要结果如下：1、铝胁迫能够显著抑制紫花苜蓿根的伸长，苏木精染色显示其作用靶点主要集中在根尖的分生区。基因芯片及生物信息学的分析结果显示，紫花苜蓿在遭受铝胁迫后，根部

4、和地上组织都刺激了大量与氧化应激相关基因的表达，而与DNA复制、转录、翻译、核糖体加工生成和蛋白修饰等过程相关基因的表达被下调，影响了细胞的正常生理活动。此外，铝胁迫在根部还抑制了细胞分裂素响应和细胞周期相关基因的表达，这可能是铝离子抑制紫花苜蓿根伸长的一个重要因素。而在地上组织则下调了与生长素响应、光合作用以及表观遗传修饰等过程相关基因的表达，这可能与铝胁迫下紫花苜蓿表现为黄化、植株矮小等症状有关。为了对抗铝胁迫引起的剧烈氧化应激反应，紫花苜蓿根部和地上组织都上调了很多抗氧化物基因的表达，根部组织还上调了大量与细胞壁修复相关的基因表达，而地上组织则上调与苯丙酸、类

5、黄酮和α-亚麻酸等次级代谢以及金属转运等过程相关基因的表达。基因芯片的结果揭示铝胁迫对紫花苜蓿根部和地上组织的毒害呈现不同的作用机制，而不同组织在响应铝胁迫后也启动了不同的反应机制。2、利用基因芯片杂交检测到铝胁迫后紫花苜蓿根部一个MATE基因的显著上调，且该基因是紫花苜蓿MATE基因家族中唯一一个与编码柠檬酸转运子基因呈现高度同源关系的成员。本研究将其命名为紫花苜蓿MsMATE基因，克隆测序的结果显示该基因由13个外显子和12个内含子组成，开放阅读框长度为1524bp，编码507个氨基酸。该基因在紫花苜蓿根、茎、叶中都有表达，但在根尖的基底水平很低。铝胁迫能够显著

6、诱导该基因在根部的表达，而且其表达水平呈现对铝胁迫的剂量依赖性和时间依赖性。除了响应于铝胁迫，紫花苜蓿MsMATE基因也对H+胁迫敏感，但对其他金属离子的胁迫不敏感。采用花序侵染法将紫花苜蓿MsMATE基因转入拟I重庆大学博士学位论文南芥铝敏感突变体STOP1-KO中表达，纯合株系中的研究结果表明MsMATE基因在拟南芥中并没有显著增加柠檬酸的释放，而且也没有提高拟南芥突变体的铝耐受性，电生理学的实验结果进一步证实紫花苜蓿MsMATE转运子对于柠檬酸的转运活性显著低于拟南芥AtMATE转运子，这很可能就是紫花苜蓿MsMATE转基因纯合株系没能回复拟南芥铝敏感突变体耐

7、铝性的主要原因。3、拟南芥很多耐铝基因受STOP1转录因子的调控，该转录因子在拟南芥的耐铝机制中发挥重要的调控功能。本研究对紫花苜蓿的MsSTOP1转录因子的研究结果显示该转录因子与其他物种中已经被证实的与铝耐受性相关的STOP1转录因子高度同源，同样具有四个极度保守的C2H2的锌指结构域。MsSTOP1基因在紫花苜蓿根、茎、叶中组成性表达，铝离子和氢离子都诱导其在根部的表达，但对其他金属离子胁迫无响应。紫花苜蓿MsSTOP1基因在拟南芥铝敏感突变体的转基因结果显示，紫花苜蓿MsSTOP1转录因子能够通过调控拟南芥AtMATE的表达，刺激柠檬酸的分泌，部分回复了