激素对诱导湿地松成熟胚胚性愈伤组织影响的初步研究

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1、万方数据万方数据1期何月秋，等：激素对诱导湿地松成熟胚胚性愈伤组织影响的初步研究75细胞胚胎发生的再生植株，但再生频率仅有10％；唐巍uu以湿地松未成熟合子胚在LP培养基上获得了胚性愈伤组织并获得了再生植株，获得再生植株的频率增加到15％。由于成熟合子胚对培养条件的要求更高，再生难度更大，因此湿地松成熟胚为起始材料诱导胚性愈伤组织则尚未见报道。然而以未成熟胚为材料，不但取材受到发育季节和地理环境的严格限制，而且增加了无菌操作的难度，大大降低了培养效率。由此，本研究以湿地松成熟胚为外植体材料，对其诱导胚性愈伤组织作了初步尝试。1材料和方法精选湿地松种子在4℃冰箱处

2、理3—4周，取出用清水洗净，0．1％高锰酸钾浸泡12h，流水冲洗lh，去壳后用70％酒精浸泡30s，无菌水冲洗3次，0．1％氯化汞消毒3—4min，无菌水冲洗数遍。用滤纸吸干，小心取出胚，置于附加不同激素的LP培养基上，并在21℃黑暗条件下培养。培养基中另附加450mg·L。1谷氨酰胺，500mg·L-1水解酪蛋白，3％蔗糖，6．5％琼脂。其pH值在灭菌前调到5．8，在121℃高温、高压下灭菌15min。2结果与分析2．1不同2，4·D、6一BA浓度对湿地松成熟胚愈伤组织的影响一般而言，松属类树种诱导形成的胚性愈伤组织为：白色透明丝状、黏度高、湿度大、相对疏松[

3、1引。从所选择的9个配方中比较来看，随着生长素2，4一D浓度的增加，形成的愈伤组织质地，逐渐由紧实变为比较疏松，由干燥变得湿润，其颜色也逐渐变为淡色。说明高2，4·D浓度对诱导湿地松的胚性愈伤组织非常必要。本实验中诱导出的愈伤组织一般在15d后逐渐出现坏死斑，但在程度上，随2，4．D和6一BA浓度的升高有所减轻。湿地松成熟胚在培养基LP+2，4一D12mg·L-1+6一BA4mg·L-1上能够诱导形成少量白色、透明的粘性的愈伤组织，且继代能够较快的增殖。这表明生长素和细胞分裂素浓度配比对促进离体胚脱分化形成胚性愈伤组织有相当重要的作用(参见表1)。表1不同2。4

4、．D和BA浓度对湿地松成熟胚愈伤组织的诱导T枷e1IIlnuenceofv州ousconcentrationsof2，4一DandBAoncallusinductionof尉，I淞e髓面蹦man啪embry08一般说来，生长素2，4．D对于针叶树胚性愈伤组织的诱导是不可缺少的【l引，因此选择适宜的2，4一D浓度非常关键。从表2可以看出，当6·BA浓度为4mg时，随着2，4一D浓度在(8—14mg·L-1)之间逐渐增加，培养出的愈伤组织生长愈加旺盛，质地也由稍显疏松而变得松散。由于蓬松状的愈伤组织已基本失去再分化的能力，所以在诱导湿地松胚性愈伤组织时应将2，4．D

5、浓度控制在14mg·L。1以内。同时从表2所反映的实验结果可知，愈伤组织褐化率也随2，4一D浓度的升高而升高。说明要诱导胚性愈伤组织，需得在选定的某一范围通过不断调整各激素浓度之间的比例，以减少褐化的频率。实验中，继代次数越多愈伤组织的褐化率越高，最终由淡色变为褐色、灰色，逐渐死亡。表26．BA浓度为4m∥L时．2，4-D浓度对湿地松愈伤组织诱导的影响Table2111nuenceofv碰ousconcemratioIls0f2-4·DoncallIlsindl】ctionofRn吣ezZ矗”饿when6．BAconcen仃ationis4mg·L一1万方数据7

6、6四川林业科技28卷在2，4．D浓度为(8～14mg·L。1)范围内，愈伤组织褐化率由31．4％升高到45％。2．2湿地松成熟胚在诱导培养基中的生长在诱导愈伤组织的过程中，湿地松成熟胚的胚根、胚轴和子叶愈伤化出现不同步的现象(见表3)。最先形成愈伤组织的是胚根部分，其次是胚轴，最后是子叶愈伤化，且随着培养时间的增加，各个部分形成的愈伤组织褐化的速度不一致。表3不同接种时间成熟胚在培养基中的变化Table3Change80fmatllreembryos0fAnw础幻“甜ininductionmediuminvariousinoculadondays3讨论一般地，优

7、良胚性愈伤组织的获得是诱导针叶树体细胞胚胎形成的首要条件。以湿地松成熟胚为外植体诱导胚性愈伤组织过程中，出现了严重的褐化现象。褐化是植物组织培养中存在的较为普遍的一种现象。它与诸多因素有关，既与外植体材料的性状有关，也与培养条件和培养方法有着密切的关系。本试验研究表明，湿地松成熟胚的胚根、胚轴、子叶诱导在诱导培养基中愈伤化的速度不一致是导致其褐化的原因之一。胚根首先形成愈伤组织，出现褐化的时间较早。愈伤组织褐化所释放的有害物质影响其邻近的组织，加快了整个组织的褐化速度。因此在培养过程中将合子胚的分成3部分培养，可获得较高质量的愈伤组织。外源生长素和细胞分裂素是针

8、叶树体细胞胚胎发生过程中