分子荧光—医学课件

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1、第四章分子荧光分析新技术§4.1分子荧光光分析法概论一．定量分析A=-lgT=εbcT=F∝()F=Φf·若用级数展开，略去高次项，得F=2.303ΦfkCk=εbΦf称为荧光的量子产率，Φf二．影响发光强度的因素Φf=S*SkckfkxTkpkc´讨论1.kf主要取决于分子结构，受环境影响较小。εmax可作为kf的定性度量εmax大，A大，kf大例如π→π*ε∨n→π*ε具有多重共轭双键的分子发射的荧光较强2.kc受环境影响最为强烈(无辐射去活速率常数）T升高，分子碰撞的几率增加，kc变大3.kx为内交联的速率常数kx既受分子结构的影响，也在一定

2、程度上受环境的影响。kx：（1）对π*→n，kx＞kf对π*→π，kx≈kf（2）溶剂的极性影响分子跃迁类型喹啉在苯中π*→n在极性Sπ*→π喹啉在苯、乙醇、水中的Φf分别为1，30，1000(1)kx依赖于S*→T的距离距离越小，kx越大(2)重原子效应在含有π轨道上的分子引入重原子之后，kx变大氟苯Φf0.16氯苯Φf0.05溴苯Φf0.01碘苯Φf0(3)不成对自旋的顺磁物质，也发现会增大系内交联速率例如：锌卟啉二甲酯螯合物具有中等强度的荧光和磷光,铜卟啉二甲酯螯合物的荧光减弱，磷光增强三．分子发光与结构的关系要使分子产生荧光，则分子结构能吸

3、收UV-Vis辐射,且要有较高的荧光效率。(1)若分子吸收UV-Vis辐射能力越强，发光越强；(2)能强烈发光的分子几乎都是经过π→π*跃迁，具有共轭双键、刚性较强的平面和多环结构的分子易于发光。取代基对分子发光有显著影响（1）给电子基团常使荧光增强如－NH2，－OH（2）吸电子基团使荧光减弱或熄灭如－COOH，－NO2，－N＝N－刚性强的分子Φf大如环的封闭作用使分子刚性增强芴Φf1.0联二苯Φf0.2有机螯合剂与金属离子形成配键时，刚性增强8-羟基喹啉与ZnΦf∨8-羟基喹啉Φf四．仪器与UV-Vis的区别：1.检测方向与入射方向垂直，以便使被

4、散射的入射光的直接检出减至最少2.两个单色器3.检测池四面透明4.激发光谱5.发射光谱LM1SM2DR五．溶液荧光的熄灭荧光的熄灭广义的包括了任何可使荧光增强度降低的作用。狭义的仅仅指那些由于荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用所引起的荧光强度降低的现象，这些会引起荧光的熄灭的物质称为熄灭剂。狭义的荧光熄灭的原因是溶液中熄灭剂分子和荧光物质分子之间发生相互作用而引起荧光物质分子的荧光效率降低或荧光物质激发态的寿命缩短，从而导致荧光强度的降低。著名的熄灭剂:卤素离子重金属离子氧分子硝基化合物§4.2三维荧光光谱法TotalLuminesce

5、nceSpectrometry一般荧光法对复杂混合物荧光光谱难以分辨，因而使它的应用受到限制。F是λex、λem的函数。Totalluminescence（TLS）Two-dimensionalspectra（TDS）Topograms一.三维荧光光谱图的表示方法1.三维投影图（isometricprojection）以λem为x轴，λex为y轴，F为z轴而构成的三维投影图。y轴λ由小到大正面图y轴λ由大到小背面图2.等高线图（contourplats）以λem为x轴，λex为y轴，把荧光强度相等的点用线连接起来，则在平面上形成等高线图，称为等高

6、线荧光光谱图。二.实验技术1.一般的荧光分光光度计分别测定各个不同激发波长下荧光发射光谱，根据所得数据用计算机绘制三维投影图或等高线图。此法非常麻烦，耗时。2.电视荧光计（Videofluorometer）电视荧光计使用快速扫描多道检测器，如光导摄像管在几毫秒内以矩阵的形式收集数据，光导摄像管的光敏表面可看成是几千个检测器的二维排列。redyellowgreenblueUVEmissionPolychromatorVIDICONλexλemExcitationPolychromatorSample3.光二极管阵列荧光计(ThePhotodiodeA

7、rrayFluorenometer)与二维光导摄像管检测器相比，光二极管阵列是一维检测器。为了得到光二极管检测器，荧光分光光度计的光电倍增管和单色器必须被二极管阵列和多色器所取代。三.三维射影图和等高图的特点1.三维投影图比较直观地观察激发－发射波长对所对应的荧光强度的信息；2.三维投影图难以用于相似样品的定量测定；3.等高线图可用于相似样品的定量比较。四.生物医学应用1.血清TDS已经被广泛用于多环芳香碳氢化合物分析、液相色谱、细菌指纹、地球化学、煤化作用研究和光化学研究，在生物医学中的应用是较新的应用研究。从血管直接抽取的血样称为全血。全血经放

8、置之后，自然分为两层，上层清析。称为血清(serum)。全血加抗凝剂以后，放置一段时间后，也会分为两层，上层的清液称为血浆