动物病毒学实验技术

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1、动物病毒学试验技术杨润德通过病毒学的学习，我们了解到病毒没有完整的酶系统，体内无核糖体等细胞器，因此不能在任何无生命的培养液中生长。所以要想增殖病毒必须在有生命的组织细胞内接种让其增殖，如：动物、鸡胚、细胞、器官。实验一、鸡胚接种发育中的鸡胚是病毒生长良好的环境，被广泛用于病毒（特别是禽病毒）的分离培养和疫苗生产等。病毒在鸡胚中的生长可以通过几种方法加以测定，如：采集尿囊液、羊水、绒尿膜、鸡胚作定量检定；采集以上样品作血凝滴定、血清学试验等；检查各部的病理学变化，如：鸡胚死亡、矮小、出血、羽毛发育不良、内脏坏死灶

2、、绒尿膜水肿或增厚、坏死性痘斑、出血。除鸡胚外，根据病毒特点可以选用其他禽胚，如小鹅瘟病毒宜接种鹅胚，鸭瘟宜接种鸭胚等。影响病毒在鸡胚中生长的因素，包括鸡胚的日龄、接种途径、接种剂量、接种浓度、培养时间、培养温度。培养温度一般为35.5-37℃，有些病毒所需的温度更低。但很多哺乳动物病毒不适合在鸡胚中生长。1.选取SPF鸡群所产的蛋；2.受精卵在10℃左右保存不超过10d；3.最好选择白色卵壳的受精卵；4.卵壳无污染，孵化前在0.1%的新洁尔灭中浸泡约15min，最后用冷水冲洗，放卵架，或将卵放卵架用甲醛（1m2

3、用13ml甲醛、6.5gKMnO4熏蒸，而且在熏蒸时维持箱内温度为37℃20min后驱散甲醛蒸汽；5.孵化温度保持39-40℃，相对湿度60-65%，有风扇维持空气流通，每天翻蛋3-4次。一、受精卵的质量和孵化根据不同病毒的嗜性，选择适宜的接种途径。最常用的途径有卵黄囊、尿囊腔、尿囊膜3种途径，偶尔接种于羊膜腔、静脉、胚体等。在分离一种未知病毒时，最好3种途经均用，如果没有足够的受精卵，首选绒尿膜接种途径，因为大多数病毒都能适应。接种材料的处理：将组织置研钵磨碎，加5-10倍盐水并加入双抗混均，2000-3000

4、r/min离心20-30min。取上清待用。二、接种途径卵黄是胚胎的营养物质，卵黄囊膜是由内胚层发育而来的，内层覆有一层绒毛。病毒可在绒毛细胞内生长，并且可以由此扩散到胚胎的其他部位。㈠卵黄囊1.取5-8日龄鸡胚，在照卵器上画出气室和胚胎的位置；2.直立于卵座上，于气室部碘酊消毒后打孔；3.用注射器取病料直刺入3cm回吸，如有卵黄吸出，推入毒液0.2-0.5ml，拔出针头封口。放孵化器中继续孵化，每天照卵2-3次。接种方法尿囊是鸡胚的排泄器官。腔内充满排泄物尿囊液。液体的容量因卵的大小而异，一般6日龄鸡胚时约1m

5、l，11日龄时约6ml，13日龄可高达10ml，以后逐渐减少直到消失。13日龄时的尿囊液是无色透明的，14日龄后逐渐变浑浊，呈乳白色，有时淡黄色。㈡尿囊腔接种1.取9-10日龄鸡胚，照卵，画出气室，离气室边缘0.3-0.5cm用铅笔作一记号；2.在气室做记号处用碘酊消毒，打孔；3.用注射器取毒液自接种孔斜刺入约1cm，注入毒液0.1-0.2ml；4.封孔继续孵化，定时照蛋。接种方法绒尿膜是鸡胚的呼吸器官，由尿囊膜和绒毛膜紧密粘合组成，无法分开。绒尿膜上有丰富的血管，照蛋时清晰可见。㈢绒尿膜接种方法一将待检液滴在气

6、室膜上，透过卵膜扩散到绒尿膜上。原理是气室卵膜性脆，刺破后不再闭合，而绒尿膜是活组织，有韧性刺破后能立即闭合，接种液不能透过。接种方法1.取9-10日龄鸡胚，照卵器画出气室范围；2.将卵直立于卵架上，气室向上，于中央消毒打孔；3.以1ml注射器配以2.5cm5-6号针头，自小空刺入气室约0.5cm，滴加待检液0.1-0.2ml于气室内的卵膜上，将针头继续垂直刺入，拔出针头，封口，继续孵化定时翻蛋。可随意放置。方法二此法做人工气室，能保证毒液接种在绒尿膜上。1.取9-10日龄鸡胚，画出气室及胚胎位置中的无血管区；2

7、.将卵横卧于卵架上，胚胎位置向上；3.在胚胎部位及气室部碘酊消毒，气室中央打孔，胚胎部位用钢锯划破卵壳但不破坏绒尿膜；4.用橡皮吸球吸气室部的空气，使卵内容物移向气室，促使破壳部位的绒尿膜下陷，形成人工气室；5.自人工气室接种待检物0.1-0.2ml；6.将卵壳移回原位或用灭菌玻璃纸封口用胶布固定；7.将卵放回孵卵箱继续孵育，人工气室向上，每日检卵2-3次。㈠检查鸡胚接种待检材料后孵化1-6d，此期间每天最少检卵2次。接种24h死亡胚一般视为非特异性死亡，弃去。以后死亡胚立即取出放置4℃内至少4h，以使血管收缩。

8、冷藏时间不得超过24h，否则胚液蒸发，气室卵膜难于剥离，影响病毒的收获。三、鸡胚接种后的检查和收获㈡鸡胚内容物的收获1.尿囊液的收获⑴将卵直立于卵架上，气室向上；⑵气室部碘酊消毒，击破并除去卵壳；⑶用灭菌镊子撕去气室部的卵膜及绒尿膜，可见尿囊液澄清透明；⑷用吸管或注射器采集尿囊液，菌检弃去细菌污染的尿囊液。2、羊水的收获⑴1-4与尿囊液的收获一样；⑵吸取尿囊液后用镊子提起