分子标记技术原理、方法及应用

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1、分子标记技术原理、方法及应用一、遗传标记的类型及发展遗传标记(geneticmarker):指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性；因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。包括形态学标记、细胞学标记、生化标记和分子标记四种类型。形态学标记：主要包括肉眼可见的外部形态特征，如：矮秆、紫鞘、卷叶等；也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有关的一些特性。优点:形态学标记简单直观、经济方便。缺点:(1)数量在多数

2、植物中是很有限的;(2)多态性较差，表现易受环境影响;(3)有一些标记与不良性状连锁;(4)形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的过程，周期较长细胞学标记：植物细胞染色体的变异：包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（C带、N带、G带等）的变化。优点:能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位。缺点:(1)材料需要花费较大的人力和较长时间来培育，难度很大;(2)有些变异难以用细胞学方法进行检测生化标记：主要包括同工酶和等位酶标记。分析方法是从组织蛋白粗提物中通过电泳和组织

3、化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型。优点:直接反映了基因产物差异，受环境影响较小。缺点:(1)目前可使用的生化标记数量还相当有限;(2)有些酶的染色方法和电泳技术有一定难度分子标记：主要指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异，也叫DNA标记。(1)数量多，高多态性，信息量大(2)与生长发育无关，取材不受限制(3)能明确辨别等位基因(4)均匀分布于整个基因组(5)选择中性，不影响目标性状的表达(6)检测手段简单、快速(7)成本低廉(8)

4、稳定，重复性好(9)共显性遗传在遗传学研究中广泛应用的DNA分子标记已经发展了很多种，一般依其所用的分子生物学技术大致可以分为三大类：第一类是以分子杂交为核心的分子标记，包括RFLP、DNA指纹技术等，这类分子标记被称为第一代分子标记；第二类是以PCR为核心的分子标记，包括随机扩增多态性RAPD、简单序列重复SSR、扩增片段长度多态性AFLP、序列标签位点STS等，为第二代分子标记；第三类是一些新型的分子标记，如：SNP标记、表达序列标签EST标记等，也以PCR技术为基础，为第三代分子标记。几种主

5、要的ＤＮＡ分子标记二、几种常见分子标记的原理及方法1.RFLP2.RAPD3.AFLP4.SSR5.ISSR6.SNP1.RFLP：RestrictionFragmentLengthPolymorphismbyBotstein(1980)基本原理：物种的基因组DNA在限制性内切酶作用下，产生相当多的大小不等的片段，用放射性同位素标记的DNA作探针，把与被标记DNA相关的片段检测出来，从而构建出多态性图谱。用某一种限制性内切酶来切割来自不同个体的DNA分子上，内切酶的识别序列有差异，即是由限制性酶切

6、位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。这种差异反映在酶切片段的长度和数目上。优点:无表型效应，不受环境条件和发育阶段的影响；共显性，非常稳定；起源于基因组DNA自身变异，数量上几乎不受限制缺点：检测步骤多，周期长，需DNA量大，费时；用作探针的DNA克隆制备、保存不方便；放射性同位素，易造成环境污染2.RAPD：RandomAmplifiedPolymorphicDNAbyWilliamsetal.(1990)基本原理：此技术建立于PCR基础之上，使用一系列具有10个左右碱基的单链随机引物

7、，对基因组的DNA全部进行PCR扩增，以检测多态性。由于整个基因组存在众多反向重复序列，因此须对每一随机引物单独进行PCR。单一引物与反向重复序列结合，使重复序列之间的区域得以扩增。引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后通过EB染色以检测DNA片段的多态性基本步骤：基本步骤：与常规PCR的两点不同：1．引物长度短————常规PCR中需要两个引物，长度20-30个核苷酸。RAPD只需一个引物，长度

8、9-10个核苷酸，而且是随机引物。2．退火温度低————在RAPD引物短，因此退火温度要低，一般为35-37℃。优点:不需DNA探针，设计引物也无须知道序列信息；技术简便，不涉及杂交和放射性自显影等技术；DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低缺点：显性，不能鉴别杂合子和纯合子；实验重复性较差，结果可靠性较低与核酸序列分析相比，RFLP可省去序列分析中许多非常繁琐工序，但相对RAPD而言，RFLP方法更费时、费力，需要进行DNA多种酶切、转膜以及探针的制备等多个步骤，仅对基因组单