碱性蛋白酶和亚硫酸钠水解菜籽粕制取菜籽多肽研究

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1、碱性蛋白酶和亚硫酸钠水解菜籽粕制取菜籽多肽的研究严梅荣摘要本文研究碱性蛋白酶Alcalase直接水解菜籽粕制取菜籽多肽，试验反应时添加亚硫酸钠的影响及使用膜分离技术去除产物中的硫代葡萄糖苷。结果表明，Na2SO3通过对蛋白质分子中的二硫键的断裂作用及对碱性蛋白酶抑制剂的影响，可提高碱性蛋白酶的活性，使得到的菜籽多肽的分子质量分布发生变化，小分子的多肽比例相应增加。结果同时显示，膜分离可有效减少或除去硫代葡萄糖苷等抗营养因子，使用截留分子质量3000u的膜对菜籽粕酶解产物进行超滤和透析过滤，当超滤浓缩因子和透析过滤体积倍数均为2时，产物的硫代葡萄糖苷含量从1.36mg/g降低到0.3

2、9mg/g。关键词菜籽亚硫酸钠蛋白质水解水解度中图分类号：TS201.2文献标识码：A文章编号：1003-0174（）--随着世界人口增长和食物来源减少促使人们研究开发新的植物蛋白资源，其中对于油籽食用蛋白的开发已引起人们越来越大的兴趣。菜籽是重要油料作物，世界年产量已超过4000万吨，中国、印度和加拿大是主要生产国。菜籽提油后的粕中含有40－50％的蛋白，且菜籽蛋白氨基酸组成平衡，符合FAO要求，因此菜籽粕可能成为食用蛋白的合适来源[1,2]。由于菜籽粕中还存在硫代葡萄糖苷，植酸和多酚类等有毒和抗营养因子，因此目前主要还是当作饲料或肥料使用，只有尽量降低或除去这些有毒和抗营养物质

3、，才有可能使菜籽粕作为食用蛋白来源。近年来，蛋白水解物被认为是生物活性肽的来源，它们易于被大肠细胞吸收进入血液，产生有益的生物活性。已报道的生物活性肽具有免疫调节、抗菌、抗血栓形成和降血压等生理功能，它们在食品、药物和化妆品工业上的应用已引起人们广泛的兴趣。由于消费者对于动物蛋白的担忧日益增加，因而更偏爱开发植物多肽。酶水解蛋白是目前制取植物多肽的最重要手段，通过水解可以得到分子质量大小不同的肽。传统的制取多肽方法是先通过碱提取酸沉淀法制取分离蛋白，再使用不同的蛋白酶将分离蛋白水解制取肽。由于菜籽蛋白成分复杂，难溶于水，通常需要使用pH11以上的强碱提取，加之菜籽蛋白等电点范围广，

4、提取后加酸调节等电点析出的分离蛋白得率较低。本文研究使用碱性蛋白酶Alcalase直接水解菜籽粕制取肽，利用膜分离除去硫苷等有毒物质，同时研究水解时加入低浓度亚硫酸钠对于反应速率的影响。1材料与方法1.1材料加拿大菜籽：张家港出入境检验检疫局提供；碱性蛋白酶Alcalase2.4L（活力2.4AU/g）：诺维信公司；芥子酶(>100units/g)：Sigma公司。1.2试剂及仪器1.2.1试剂石油醚（30～60℃），氢氧化钠，盐酸，磷酸，柠檬酸，二氯甲烷，氨水，亚硫酸钠等：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司生产。1.2.2仪器7JLGJ45检验砻谷机：浙江黄岩粮仪厂；LXJ-Ⅱ

5、离心沉淀机：上海医用仪器厂；PHS-3精密pH计：上海雷磁仪器厂；HH-20数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；SHA-C恒温振荡器：常州国华电器有限公司；旋涡混合仪：上海沪西分析仪器厂；L-117实验室喷雾干燥机：京来亨科贸有限责任公司；AKTAPpurifier蛋白纯化仪:GEHealthcareBio-ScienceAB公司；752紫外可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司。1.3实验方法1.3.1菜籽脱壳菜籽在砻谷机中碾压后风扬去掉皮层，粉碎，待提取油脂。1.3.2菜籽脱油使用自制索氏提油装置提取菜籽油脂，该装置结构和原理与市售测定含油量用索氏抽提器相同，但进行了相应放

6、大，每次提油的脱壳菜籽量为250g。使用石油醚经12h抽提脱去油脂，室温晾干除去溶剂得到菜籽粕，粉碎过80目筛后备用。1.3.3菜籽粕的主要组分测定水分含量的测定GB5497-85(1050C恒重法)含油量的测定GB5512-85蛋白质含量的测定GB5511-85灰分含量的测定GB5505-851.3.4硫代葡萄糖苷的测定方法按Watter等[3]的方法测定。准确称取样品0.1g于10ml磨口试管中，加入3mg芥子酶，1mLpH7的磷酸－柠檬酸缓冲溶液和2.5mL二氯甲烷，盖塞后室温振荡2h进行酶解反应。将反应液以3000r/min离心20min。移取50μL二氯甲烷吸收液加入到3

7、mL20%氨水乙醇溶液中，500C恒温水浴反应2h，反应结束后冷却，以50μL二氯甲烷加3mL20%氨水乙醇溶液作空白，测定异硫氰酸酯（ITC）在235nm、245nm和255nm波长处的吸光度。用3mL95%乙醇代替20%氨水乙醇溶液按上法操作，并以50μL二氯甲烷加3mL95%乙醇作空白，测定恶唑烷硫酮（OZT）的吸光度。按下列公式计算硫苷含量：OD245校=OD245-(OD235+OD255)/2OZT（mg/g）=OD245校×22.1ITC（mg/g）=O