甲基强的松龙对深低温停循环大鼠脑保护作用的研究

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1、甲基强的松龙对深低温停循环大鼠脑保护作用的研究作者：顾群，莫绪明，陈凤，彭卫，何晓敏，戚继荣，顾海涛【摘要】目的观察甲基强的松龙对深低温停循环大鼠脑N甲基D天门冬氨酸受体R1表达的影响，探讨MP对DHCA大鼠脑保护作用的机制。方法制作大鼠DHCA模型。雄性SD大鼠175只，随机分为假手术组、DHCA模型组和MP处理组。观察DHCA0min，再灌注2、6、1h及1、2、3、d时NMDAR1蛋白表达的变化以及脑组织超微结构变化。结果免疫组化结果显示，DHCA模型组和MP处理组大鼠NMDAR1蛋白表达均升高，于1

2、d到达高峰，后逐渐降低，于再灌注d恢复至正常水平。MP处理组大鼠再灌注后2、6、1h，1、d个时间点NMDAR1表达明显低于模型组。脑组织超微结构观察发现MP能抑制DHCA脑细胞凋亡。结论MP对DHCA大鼠脑组织具有保护作用，其作用机制之一可能是与抑制NMDAR1蛋白表达有关。【关键词】深低温停循环;甲基强的松龙;N-甲基-D-天门冬氨酸受体R1;脑保护;蛋白表达深低温停循环技术自上世纪50年代诞生以来，已广泛应用于复杂和严重的先天性心脏病及大血管手术中，但其可能并发脑损伤的问题尚未得到较好解决，DH-CA

3、术后中枢神经系统的发病率高达4%～25%。DHCA手术后患者近期不同程度出现手足舞蹈症、抽搐，远期出现认知障碍，儿童出现智力发育障碍等神经系统并发症［1］。DHCA后脑组织缺血缺氧导致突触前兴奋性氨基酸大量释放和再摄取减少，从而激活突触后N甲基D天门冬氨酸和α氨基羟基甲基4异戊丙酸受体，引起大量K+外流和Na+、Ca2+内流，造成渗透分解和Ca2+相关性损害。本实验通过观察甲基强的松龙对DHCA大鼠脑NMDA受体1蛋白表达的影响，以探讨其脑保护机制。　1材料与方法仪器与试剂早产儿培育箱、自制大鼠冰窝、水合氯

4、醛、MP、NMDA受体R1，羊抗兔即用型SABC免疫组化检测试剂盒SA1022、DAB显色剂、多聚赖氨酸、荧光倒置显微镜、801图像分析系统。1.动物成年健康雄性普通级SD大鼠175只，体重250～300g，随机分为3组，A组15只;B组和C组各80只，每组再分为DHCA后2、6、1h，1、2、3、d共7个小组，每小组10只，其中DHCA后h、1d两个组为15只。术前h禁食禁水。A组仅暴露双侧颈总动脉，不降温不阻断;B组深低温停循环60min;C组于深低温停循环前30min腹腔注射MP，剂量为30mg·kg

5、-1。1.大鼠DHCA模型建立术前30min肌肉注射阿托品·kg-1，5%水合氯醛ml·kg-1腹腔注射麻醉，大鼠仰卧固定于实验台上。温度计插入肛门cm，用胶带将其与鼠尾相固定，监测肛温。颈部正中切口，分别游离两侧颈总动脉及左、右颈外动脉，并双重过线。游离一侧股动脉，动脉置管，取动脉血作血气分析后，用肝素充满连接管后接压力换能器，多功能监护仪监测血压、心电变化及外周血氧饱和度。最后将大鼠放入特制的冰窝，物理降温，每隔5min记录体温、心率、血压以及血氧饱和度，调整降温速度。当肛温降至21℃时，将大鼠取出，取

6、动脉血做血气分析后，经左股动脉进行肝素化。随后用24G静脉留置针顺行穿刺左颈外静脉，扎线固定后与三通相连。接着阻断两侧颈总动脉，最后用24G静脉留置针逆行穿刺颈外动脉，扎线固定留置针，与左侧颈外静脉的静脉留置针相连，开始转流。转流后，将体温维持在℃之间，并记录体温、心率、血压以及血氧饱和度。停循环60min后，拔出颈外动脉处留置针并结扎，回收其管道内血液，经左侧颈外静脉输入，再退出其管内留置针并结扎。最后松开两侧颈总动脉处动脉夹，恢复颈总动脉血流，检查穿刺处无出血后，逐层缝闭切口。然后将大鼠放入35℃早产儿

7、培育箱复温，恢复正常体温h后放置室温下正常饲养。　　1.免疫组化方法检测NMDAR1蛋白表达各组取10只大鼠于DHCA后相应时间点，用含4%多聚甲醛的mol·L-1磷酸缓冲液经心脏升主动脉灌流固定，断头置于冰盒玻璃板上取出全脑，放入同样固定液中再固定约2h，常规脱水石蜡包埋切片，厚度4μm，取4张连续切片，操作步骤按SABC试剂盒操作说明进行，阴性对照以PBS代替一抗。应用捷达801分析软件测定阳性细胞的灰度值，每张切片随机选择4个高倍视野观察并取其平均值，以灰度值来表示NMDAR1的表达水平，灰度值越高，

8、免疫组化染色越浅，NMDAR1表达越低。1.脑组织超微结构观察于DHCA再灌注后h和1d，各组取5只大鼠处死，每只大鼠于海马区取1mm×1mm×1mm的小块组织，于%戊二醛固定后，经mol·L-1的磷酸缓冲液冲洗，1%锇酸固定，丙酮脱水，纯树脂浸透包埋，固化后切片。切片厚度为50～60nm，醋酸铀与枸缘酸铅染色，透射电镜下观察神经元及神经胶质细胞超微结构的变化。1.统计学处理　　　　所有数据以x-±s表示，用SP