可调控重组腺相关病毒对MCF7细胞基因转染效率及表达的研究

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1、可调控重组腺相关病毒对MCF7细胞基因转染效率及表达的研究作者：王燕燕，宋兴福，崔向军，黄骥【摘要】目的研究青蒿琥酯(artesunate,Art)体外诱导人肺腺癌A549细胞凋亡及对半胱天冬氨酸蛋白酶9(cystEinecontainingaspartate9,caspase9)和caspase3活性的影响。方法Art处理A549细胞，流式细胞计数(FlowCytometry,FCM)检测细胞周期和细胞凋亡，比色法检测caspase9活性，westernblot检测caspase3变

2、化。结果FCM显示A549细胞经100mg/LArt作用24h，出现S期细胞减少(P【关键词】青蒿琥酯；A549细胞；细胞凋亡；caspase9；caspase3Abstract：ObjectiveToinvestigatetheeffectsofartesunateonapoptosisofhumanadenocarcinomacelllineA54cellsandactivationofcystEInecontainingaspartate(caspase9)andcysteineco

3、ntainingaspartate(caspase3).MethodsA54cellsweretreatedwithartesunate,cellcyclephase'sdistributionandapoptosisweredetectedbyflowcytometry.Activationofcaspasewasidentifiedbycolorimetricassay.Changeofcaspasewasdetectedbywesternblot.ResultsWithartesun

4、atetreatment,markedcellaccumulationinG2/Mphasewasobservedafter100mg/LArtexposurefor4h.Inaddition,thepercentageofapoptosisincreased,from(±)%incontrolculturestoapproximately%after100mg/LArttreatedfor4h.caspasecolorimetricassayshowedbasallevelsofcaspas

5、eactivityinA54cells,andafterArttreatment,caspaseactivityincreasedinadosedependentmanner.AfterA54cellstreatedwith100mg/LArtforh,12hand4h,theactivityofcaspaseincreasedwithfoldof,(PKeywords：Artesunate;A54cells;Apoptosis;caspase9;caspase3　　0引言青蒿素及其

6、衍生物是我国自主知识产权的高效抗疟药。近年来的研究发现青蒿素及其衍生物除了具有抗疟作用以外，对人类多种肿瘤细胞在体外有杀伤作用或抑制作用[15]，但其作用机制尚不十分清楚。为了探讨青蒿素的衍生物之一青蒿琥酯(Artesunate,Art)的抗癌机制，我们采用Art诱导人肺腺癌A549细胞凋亡，并检测caspase9和caspase3活性变化，结果表明，Art可使A549细胞中caspase9和caspase3的活性明显增加，现报道如下：　　1材料与方法主要试剂及仪器Art，桂林南药股份

7、有限公司，批号050201；1640培养基和胰蛋白酶，Gibco公司；胎牛血清，杭州四季青公司；碘化丙啶,Sigma公司；caspasecolorimetricassaykit，Calbiochem公司；ECLkit，KirkegaardPerryLaboratories公司；兔多克隆抗caspase3抗体和βactin(C2,sc8432)均为SantaCruz产品；丙烯酰胺、N，N甲叉丙烯酰胺、SDS、Triscl、牛血清白蛋白、硝酸纤维素膜、考马斯亮兰R250、过硫酸胺均为A

8、mersco产品。酶标仪(GENiosVA200)，奥地利TECAN公司；流式细胞仪，美国Beckman公司；凝胶成像系统(BioID)，法国VL公司。细胞培养人肺腺癌细胞株A549,购自武汉大学中国典藏物保存中心，接种于含10%FCS的RPMI1640培养液中，置37℃、5%CO2孵箱中常规培养，每2～3d传代1次。流式细胞计数检测细胞周期和凋亡100mg/LArt处理细胞，24h后收集细胞，用冷PBS漂洗，滴加80%乙醇-20℃固定过夜。RNA酶(1mg/ml)37℃孵育30min，冰上2