page,sds-page电泳分离

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1、蛋白酶分离纯化技术2005/2006华南师范大学生命科学学院第七节电泳分离带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。电泳方法各式各样，使用的支持物(体)的不同，可以分为纸电泳薄层电泳(硅胶G薄层)薄膜电泳(醋酸纤微素薄膜)凝胶电泳等电聚焦电泳一电泳的基本原理不同的蛋白酶的带电性质（带电量和带何种电荷），大小和形状不同，在一定的电场下，它们的移动方向和移动速度也不同，从而得到分离。⃈可分离不同的蛋白酶(制备性电泳)⃈分析其蛋白性质如分子量和等电点等(分析性电泳)⃈移动方向颗粒在电场中的移动方向，决定于它们所带电荷的种类※带正电荷

2、的颗粒向电场的负极移动※带负电荷的颗粒则向电场的正极移动※净电荷为零的颗粒在电场中不移动⃈移动速度在电场中，颗粒的泳(移)动速度通常用迁移率来表示。迁移率是指带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度在电场中的泳动速度主要决定于‽颗粒（蛋白酶）本身所带的净电荷量净电荷量越多,泳动速度越快‽颗粒（蛋白酶）的大小分子量越小,泳动速度越快‽颗粒（蛋白酶）的形状球型较快,泳动速度越快‽电场强度越大,泳动速度越快‽溶液pH值溶液pH值决定了溶液中蛋白酶的带电的性质如带何种电荷个带电的多少‽离子强度溶液的离子强度越高，颗粒的泳动速度则越慢。反之则越快。一般电泳溶液的离子

3、强度为0.02-0.2‽电渗在电场中，液体对于固体支持物的相对移动称为电渗在毛细管电泳中，毛细管是由石英为材料，含硅酸成分，带负电荷，使毛细管中溶液感应而带正电荷。水分子便向负极移动，并带动溶液中的蛋白酶等颗粒一起向负极移动€若蛋白酶带负电，泳动速度则变慢一般要选择电渗较少的固体支持物(不带电)€若带正电，泳动速度则加快€若不带电，颗粒也会向负极移动二，电泳技术的应用范围‽酶的纯度鉴定（分析电泳）SDS-PAGE、PAGE、IEF（电泳纯）‽酶全酶和亚基分子量测定SDS-PAGE、PAGE‽pI测定IEF‽酶的分离纯化（制备电泳）三，主要采用的电泳技

4、术(支持物)‽聚丙烯酰胺凝胶电泳同时具有电荷和分子筛的双重作用，故具很高的分辨率€Native-PAGE---蛋白在天然状态下的电泳€SDS-PAGE------蛋白在SDS变性下的电泳‽琼脂糖凝胶电泳(核酸电泳)琼脂糖凝胶为电泳的支持物.方便但分辨率低‽醋酸纤维素薄膜电泳◆聚丙烯酰胺凝胶的形成※丙烯酰胺和甲叉双聚丙烯酰胺为聚合单体,在聚合催化剂的催化下,聚合为聚丙烯酰胺凝胶※聚合的催化剂▲过硫酸铵和四甲基乙二胺(TEMED)▲光和化学核黄素四聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)※丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺有毒，液体无毒，固体.聚合聚丙烯酰胺凝胶催化剂◆聚合

5、单体丙烯酰胺的浓度和凝胶孔径的关系◆均一胶和梯度胶⃎聚丙烯酰胺凝胶通常由浓缩胶和分离胶组成⃎浓缩胶:丙烯酰胺浓度均为4%,起蛋白上样和浓缩的作用⃎分离胶:起分离蛋白的作用,丙烯酰胺浓度可以是相同的(均一胶),也可以是不同的(梯度胶)◆梯度胶电泳的特点※分离胶的丙烯酰胺浓度由上至下形成从低到高的连续梯度,一般是4%-20%分辨率高可连续上样电泳时间长可消除电荷对迁移率的影响◆浓度梯度凝胶的配制‸需采用梯度混合器，配制时，浓溶液置于混合室，稀溶液置于贮存室◆碱性电泳系统‸用pH8.3的电泳缓冲液，电泳向正极进行.下槽接正极，上槽接负极，以溴酚蓝为指示染料

6、‸最常用‸可用于分析绝大多数的蛋白酶，因为其pI<8.3，即蛋白酶带负电◆酸性电泳系统‸采用pH4.0左右的电泳缓冲液，电泳向负极进行.下槽接负极，上槽接正极，以亚甲基绿作指示染料‸适用于分析酸性和碱性蛋白，即pI>4.0的蛋白均适用◆PAGE的用途‸分析蛋白酶的纯度※蛋白泳动与蛋白大小，电荷和形状有关，凝胶兼有分子筛的功能※电泳的分辨率很高，可以把不同的蛋白酶分开※一条带表明纯度高（电泳纯）★蛋白酶在电场中的泳动速度决定于：⊕蛋白酶的净电荷量⊕蛋白酶形状和大小（全酶分子量）‸分析蛋白酶的全酶分子量⊕电场强度⊕溶液pH值⊕离子强度⊕电渗★全酶分子量的

7、对数(LogMr)和泳动距离成反比◆PAGE的局限性☆如果蛋白和杂蛋白的pI相差很大，也要注意有些杂蛋白容易被忽视，因为两者泳动方向不同☆蛋白和电泳缓冲液的pH相同，蛋白不会泳动☆如果蛋白酶不同的多聚态并存，纯度高但也可能呈2-3条带☆电泳和其它方法如HPLC（高压液相色谱）结合起来，判断蛋白酶的纯度会更可靠!五SDS-PAGE在十二烷基硫酸钠(SDS)存在的条件下所作的聚丙烯酰胺凝胶电泳,称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称SDS-PAGEₒ巯基乙醇使蛋自中的二硫键还原ₒ1g蛋白和1.4gSDS结合形成蛋白-SDS胶束。SDS带大量的负电荷ₒSDS

8、破坏蛋白质的非共价键◆SDS-PAGE的原理→各种蛋白-SDS胶束均带负电,且电荷量相近,电泳迁泳率只取决于