fcm原理及临床应用课件

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1、流式细胞术检测原理及其在临床医学中的应用流式细胞术(flowcytometryFCM)是利用流式细胞仪对单个生物颗粒(红细胞、白细胞、各类组织细胞、血小板、微生物等)以及人工合成微球的物理和生物学特性进行多参数定量分析，并能对特定细胞群体加以分选的分析技术。流式细胞术的概念FCM的工作原理流式细胞仪组成：1.液流系统2.光学系统3.数据处理系统1.液流系统：由样本和鞘液组成。待测细胞被制备成单个细胞的悬液，经荧光染料标记的McAb染色后置入样品管中，在清洁气体压力下进入流动室形成样本流。在鞘液(sheath)的

2、约束下，通过喷嘴，使其形成单细胞液柱。FlowCellInjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid鞘液：辅助样本流能被正常检测的基质液作用：1.包裹在样本流的周围，使其处于喷嘴中心，以保证检测的精确性；2.防止样本流中的细胞靠近喷孔壁而堵塞喷孔。2.光学系统：由激发光源、分光镜、光束成形器等组成。激光是较常用的光源,稳定性好、单色性好。检测信号：散射光和荧光信号被收集、处理、转化为数字信号。InjectorTipFluorescencesig

3、nalsFocusedlaserbeamSheathfluidFCM检测信号散射光信号前向散射光（fowordscatter,FS）：在激光束正前方的检测器，用于检测细胞或其他粒子物体的表面属性，如大小、形状等。反映颗粒的大小。侧向散射光（sidescatter，SS）：与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器，主要用于检测细胞内部结构属性，可获得细胞内超微结构和颗粒性质的参数。反映颗粒的内部结构复杂程度、表面的光滑程度。荧光信号(反映被染上荧光的颗粒数量多少）荧光信号每种荧光染料都有特定的激发波长，受激光激发后会

4、产生特定波长的荧光和颜色，如绿色、红色、黄色等。流式细胞仪就是利用不同波长的光学滤片来检测这些特定发射波长的光学信号。荧光信号反映被染上荧光的细胞数量的多少。3.数据处理系统：主要由计算机及其软件组成。通过检测散射光及荧光信号对实验数据进行分析存储、显示。具有智能化、自动化特点。免疫荧光标记直接免疫荧光染色法：选用的荧光标记单克隆抗体是直接针对细胞表面抗原特异性标志的单一抗体，如抗CD3-FITC抗体、抗CD4-PE抗体、抗CD8-PeCy5抗体。间接免疫荧光染色法：选用特异性McAb与相应抗原结合后，再用荧光

5、素标记的第二抗体进行染色。双标记或多标记分析：目前使用的流式细胞仪能用一个激光束激发检测三色甚至四色荧光信号。检测时需注意荧光补偿。常用免疫荧光染料组合荧光补偿：每两种荧光信号间不可避免会出现重叠现象，重叠区越大，信号检测的准确性就越差，因此需计算机工作软件进行自动跟踪调节补偿。流式细胞仪的基本功能细胞表型分析：包括细胞膜、胞浆内蛋白表达及核膜成份分析DNA含量及细胞周期分析：DNAcontentanalysis，如细胞凋亡检测细胞分选：cellsorting自身免疫性疾病相关HLA抗原分析、自身抗体的检测：如

6、用Hep-2细胞检测抗核抗体。临床免疫学临床血液学临床肿瘤学血栓与止血骨髓和器官移植基础医学研究流式细胞术的临床应用FCM在临床免疫学中的应用(1)淋巴细胞亚群分析T细胞：CD3+CD4+(Th)CD8+(Ts/Tc)B细胞：CD19+NK细胞：CD3-CD16+CD56+(2)淋巴细胞亚群细分T细胞：Ts：CD8+CD28-Tc：CD8+CD28+Th：CD4+CD29+B细胞：B1：CD5+B2：CD5-根据T淋巴细胞分泌细胞因子的不同还可将CD4+、CD8+分为CD4+:Th1:CD4+IFN-r+Th

7、2:CD4+IL4+Th0:CD4+IFN-r+IL4+CD8+:Tc1:CD8+IFN-r+Tc2:CD8+IL4+Tc0:CD8+IFN-r+IL4+辅助性T细胞亚群的生物学功能及临床意义Th1细胞：介导细胞免疫、细胞毒性T细胞的生长和活化、巨噬细胞的活化、介导迟发型过敏反应。其功能亢进将导致炎症慢性迁延，器官特异性自身免疫病，急性排异反应和接触性皮炎等的发病和免疫病理损伤。Th2细胞：介导体液免疫，促进B细胞的生长、活化和分化，是IgG1和IgE类抗体的转换因子，其功能亢进将导致特异性过敏反应，参与高I

8、gE综合症和嗜酸性粒细胞增多症。(3)活化淋巴细胞亚群活化总T细胞：CD3+/HLA—DR+静止总T细胞：CD3+/HLA—DR-活化CD4+细胞：CD4+/HLA—DR+活化CD8+细胞：CD8+/HLA—DR+活化诱导分子：CD69白细胞介素2低亲和力受体：CD25CD25+/CD3+：活化T细胞CD25-/CD3+：静止T细胞(4)淋巴细胞功能分析：细胞介导细胞毒试验、细胞内细胞