pcr引物设计原则new

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1、引物设计原则http://www.hbzhan.com/st50195/Info_11672.html最近更新时间：2011年4月26日提供商：上海沪宇生物科技有限公司资料大小：0K文件类型：下载次数：0次资料类型：浏览次数：61次相关产品：详细介绍： PCR引物设计的原则引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。具体实现这3条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度(primerlength)，产物长度(productlength)，序列Tm值(melt

2、ingtemperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internalstability,用?G值反映)，形成引物二聚体(primerdimer)及发夹结构(duplexformationandhairpin)的能值，在错配位点(falseprimingsite)的引发效率，引物及产物的GC含量(composition)，等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点：1.引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于

3、TaqDNA聚合酶进行反应[2]。2.引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。3.引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。4.引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不

4、利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大[2][5]。5.引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(thenearestneighbormethod)[6][7]。6.?G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端?G值较低(绝对值不超过9)，而5’端和中间?G值相对较高的引物。引物的3’端的?G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应[6]。7.引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5k

5、cal/mol)易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行[8]。8.对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的PCR因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。[2]扩增较大片段DNA的PCR方法一般PCR方法在扩增大片段DNA时的局限性：通常所用的PCR方法都在两个方面有局限，即目标产物精确程度和合成片

6、段的大小。Pfu(Pyrococcusfuriosus)DNA聚合酶，具有完整的3'外切酶校读活性(3'-editing-exonuclease)，可以将每个循环中碱基的错配率由10*-4降到10*-3，从而提高PCR产物的准确性。但它在扩增1.5-2.0kb片段时，效率比Klentaql(TaqDNA聚酶N-末端缺失突变体，类似于E.coliDNA聚合酶IKlenow片段)或AmpliTaq(全长的TaqDNA聚合酶)等聚合酶差；在扩增5.0-7.0kb片段时亦不比各种形式的TaqDNA聚合酶(如AmpliTaq、Klentaq1、Klentaq5等N-末端缺失的变异株)有

7、明显优越之处。因而以往的PCR反应产物限制在5.0kb以内。超出这一范围，PCR扩增反应效率将明显下降，同时产物会降解。即使将延伸时间定为30分钟(10倍于通常所需)亦无改进。利用两种DNA聚合酶进行较大片段DNA的扩增美国华盛顿大学医学院的BarnesWM等对前述问题进行了深入系统的研究，认为：PCR反应效率低最主要的原因是由于错配的碱基阻碍了延伸反应的正常进行，PfuDNA聚合酶虽然可以通过“校读”功能纠正错配的碱基，但亦可能降解引物，尤其是在较长反应时间下；酶浓度较高时，反应效果更差。因此必需将P