crispr技术操作指南

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1、CRISPR技术操作指南十年前，当研究人员开始解析细菌和古细菌中一个称为CRISPR结构的时候，他们并没有预料到这会给基因编辑世界带来一场风暴。在过去的这一年半时间里，CRISPR方法已迅速席卷了整个动物王国，成为DNA突变和编辑的一种“马上”技术——迄今为止在几乎每种实验细胞类型中都能起作用，包括人类细胞，小鼠，斑马鱼和果蝇细胞；这种技术也易于操作，已经有两个研究组利用CRISPR分析了人类细胞中几乎每个基因单突变（详细报道 Science：CRISPR/Cas9加速基因挖掘；Science：张峰建立CR

2、ISPR/Cas9人细胞敲除体系）。就在最近，CRISPR还帮助研究人员完成了携带特殊基因中断（genedisruptions）的工程猴，这项壮举此前曾在小鼠中实现过，但未在灵长类动物中完成过（详细报道Cell：中国科学家利用CRISPR/Cas9技术构建基因工程猴）。CRISPR本身是一种防御系统，用以保护细菌和古细菌细胞不受病毒的侵害。在这些生物基因组中的CRISPR位点能表达与入侵病毒基因组序列相匹配的小分子RNA。当微生物感染了这些病毒中的一种，CRISPRRNA就能通过互补序列结合病毒基因组，并表

3、达CRISPR相关酶，也就是Cas，这些酶都是核酸酶，能切割病毒DNA，阻止病毒完成其功能。将CRISPR/Cas系统用于其它非细菌细胞需要满足两个条件：一个Cas酶，用于切断靶标DNA，比如目的基因中的DNA片段，另外一个就是称为导向RNA（gRNA）的RNA分子，这种分子能通过互补结合靶标。gRNA也就是细菌细胞中CRISPRRNA的一个更短的版本，它能与Cas形成复合物，指导Cas到达正确的剪切位点。不过研究人员也可以通过结合其它元件，或者改变Cas活性，来调整这种工具在基因校正和基因调控方面的作用。

4、“目前，非传统基因编辑应用方面的生物学家利用一种新工具，分析细胞中，和整个生物机体中突变的作用”，来自加州大学伯克利分校的生物化学教授JenniferDoudna表示，她与她的同事解析了细菌细胞中CRISPR的作用机制。近期，Doudna研究组利用这种工具，首次通过小鼠受精卵基因编辑构建了敲除小鼠。不过CRISPR技术也存在一个主要的缺点，那就是缺乏特异性：一些gRNA分子结合的DNA只是部分与gRNA互补。在这一方面，其它基因编辑方法，如锌指核酸酶（ZFN）和TALENS可能要比Cas-gRNA更为具有优

5、势，因为这两者需要识别更长的靶标DNA序列。但是ZFN和TALENS方法在克隆和细胞表达方面要比gRNAs难得多，而且研究人员通常还需要验证十几个不同的TALENS，以及几十个不同的ZFNs，来证明其中一个有效。近期《科学家》（TheScientist）杂志汇总了基因编辑过程中Cas和gRNA的处理过程及解决方案，用于帮助新接触这一技术的研究人员熟悉这项热门技术。如何CRISPR我的靶标？由于CRISPR系统并不复杂，因此我们所要做的就是将带有质粒（能表达Cas和gRNA）的细胞进行转染。研究人员可以采用一

6、种Cas的变体，即Cas9，这种酶来自于一种链球菌，由RNA进行指引，能无需其他蛋白的帮助而切割DNA（Science,337:816-21,2012）。Cas9既能切断与gRNA结合的DNA链，也能切断其互补链。目前可以从Addgene购买Cas9质粒（65美元），将其直接转染入细胞。gRNA的长度约为80个核苷酸，包含两个区域：gRNA5'端前20个核苷酸对应于靶标DNA，能结合在靶标DNA上，剩余的约60个核苷酸（gRNA长度取决于表达gRNA的质粒）形成一个发夹结构，这个结构能帮助gRNA与Cas9

7、结合，并由此指导与DNA的结合。gRNA与Cas9一样，也是通过质粒表达的，从Addgene可以购买几种这种质粒（65美元），但是与Cas9不同的是，我们需要自己定制与靶标相匹配的表达质粒。我们可以设计一个编码20个碱基，与靶标DNA结合的片段，将其克隆进表达质粒里（编码gRNA其它部分的60个核苷酸已经在质粒中了）。唯一的设计要求就是，gRNA上要有一个片段，能与由任意核苷酸序列（N）+5'末端两个胞嘧啶核苷酸（-NCC）的DNA结合。这是因为gRNAs似乎与相对链包含两个鸟嘌呤残基（-NGG）的DNA片

8、段结合最好，这种-NGG序列也就是PAM结构（protospaceradjacentmotif）。要在靶标DNA区域中挑选合适的20个碱基对，有几个方案可以选择，比如麻省理工学院的CRISPRDesign（crispr.mit.edu）；德国癌症研究中心开发的E-Crisp（www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr）；还有ZiFiTtargeter（zifit.partners.o