实验六_考马斯亮蓝染色显示细胞骨架20094课件

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1、考马斯亮蓝染色显示细胞骨架实验六一、实验目的1、了解细胞骨架成分显示方法的原理和操作步骤；2、观察微丝在细胞中的分布。二、实验原理考马斯亮蓝R250(CoomassieblueR250)是一种蛋白质染料，能非特异地显示细胞骨架蛋白。用含去垢剂TritonX-100的缓冲液处理细胞，可将细胞的膜结构和部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白质却被保留，用考马斯亮蓝R250染色后，在光学显微镜下可见一种网状结构，其主要成分为直径40nm左右的微丝束。观察时可能会发现细胞膜上有些孔洞，甚至有些细胞变空了，这可能是由于TritonX-100处理时间过久破坏细胞结构所致。作用：在细胞的形态维持、

2、细胞的运动、物质运输、能量转换和细胞分裂中发挥重要作用。三种组成成分：微丝、微管、中等纤维细胞骨架：指真核细胞中位于细胞质、细胞核的蛋白质纤维组成的网架系统。核糖体内质网微丝线粒体微管微梁网络细胞骨架的特征1、动力学可变性：各种细胞运动如肌肉收缩、鞭毛摆动、纤毛煽动、有丝分裂期的染色体移动及各种细胞运动均依赖于细胞骨架。如有丝分裂期由微管组成的纺锤丝的延长与缩短。细胞骨架在细胞内处于不断的重组状态。2、与细胞器等发生可逆的联系：细胞骨架可决定细胞器及一些生物大分子的定位及运动，因而对细胞器及一些生物大分子的移动、运输、分泌等许多重要细胞学功能甚至整个细胞的代谢活动的调节都有密切关系。

3、免疫荧光染色：左：微丝，中：微管，右：中等纤维微管微管的形态结构：中空的圆柱状结构。横断面上看是由13根原纤维纵向围绕而成。12345678910111213单管AB二联管ABC三联管细胞质中大部分微管为单管主要构成鞭毛、纤毛。主要构成中心粒。微管的化学组成：微管蛋白(55ku450aa)微管蛋白(55ku550aa)异二聚体2个鸟嘌呤核苷酸结合位点。秋水仙素、长春花碱结合位点。首尾相连原纤维（13）微管二价阳离子结合位点。微管的功能：维持细胞形态：微管具有一定刚性，在保持细胞外形方面起支撑作用。细胞突起部分，如伪足、鞭毛、纤毛、神经轴突的

4、形成和维持，都是微管在起关键作用。细胞与细胞器运动：中心体；鞭毛和纤毛的结构（“9+2”图式）参与物质的运输：线粒体、突触小泡、前溶酶体小泡、内吞小泡等，与膜更新有关的蛋白质，都是通过微管运输的。肌细胞：微丝形成特定的稳定结构；非肌细胞：微丝常分布在细胞膜下方，多呈现一种动态结构。微丝形态：是一类由蛋白纤维组成的实心纤维细丝。6-7nm，长短不一。在细胞中：微丝可成束、成网或纤维状分散分布非肌细胞中肌动蛋白单体（G-actin）与纤维（F-actin）在一定条件下互相转化。在含有ATP和Ca2+、低浓度的单价离子(Na+、K+等)溶液中微丝趋向解聚G-actin；在含有Mg2+和

5、高浓度的Na+、K+离子溶液中微丝趋向聚合（G-actin—F-actin），溶液ｐＨ＞7，易于进行微丝的组装。本实验中M缓冲液提供的离子条件可使F-actin稳定。细胞松弛素可特异性的破坏微丝组装；鬼笔环肽：稳定、促进微丝聚合。中等纤维形态与分布：中等纤维是一类中空的纤维状结构，单根或成束分布于细胞质中，常形成精细发达的纤维网络，外与细胞膜有细胞外基质相连，内与核纤层有直接的联系。中等纤维与微丝、微管及其他细胞器也有着错综复杂的纤维联络。显示细胞骨架的非特异性方法培养的成纤维细胞用Coomassieblue染色的结果。显示细胞骨架成分的特异性方法1、特异性的药物结合反应：如罗丹明

6、标记的鬼笔环肽，可以显示微丝。2、免疫细胞化学方法：制备细胞骨架蛋白的特异性抗体，用免疫荧光、免疫酶标的方法显示细胞骨架。电子显微镜下的细胞骨架小肠上皮细胞的冰冻蚀刻的电镜照片，显示细胞质膜下面的细胞骨架网络——终末网。三、实验用品每一个学生复式显微镜（带油浸物镜）（microscope）每一组学生擦镜纸（lenspaper）；记号笔；小片滤纸；载玻片；盖玻片；剪刀；小镊子；移液枪；1ml枪头；洋葱鳞茎（置于小烧杯中）9个5ml离心管：①1%TritonX-100；②③M缓冲液；④⑤3%戊二醛；⑥⑦磷酸缓冲液；⑧⑨0.2%考马斯亮蓝R250染色液（可从试剂瓶中吸取）四、实验操作1．用

7、小镊子撕取洋葱鳞茎内侧的表皮，剪成约1cm见方（每人做两片，不要太大，否则不易展开），分别放在两离心管[一离心管放两片]（①含0.5ml1%TritonX-100，②含0.5mlM缓冲液对照），处理20分钟。2．将①中的洋葱表皮用镊子夹出，放入③0.5mlM缓冲液的离心管中处理5分钟。对照②维持原样。3．将②③管中的表皮夹出，分别放入④⑤0.5ml3%戊二醛固定液的离心管中固定20分钟。4．将④⑤管中的表皮夹出，分别放入⑥⑦0.5ml的磷酸缓冲液的离心管中