技术简介ppt课件

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1、第四讲PCR技术简介PCR技术简介-定义PCR:polymerasechainreaction聚合酶链式反应简单的讲，PCR技术即通过引物延伸核酸的某个区域而进行的重复双向DNA合成。PCR技术是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术，亦称为无细胞分子克隆技术。它是以待扩增的两条DNA链为模板，在一对人工合成的寡核苷酸引物的介导下，通过耐高温DNA聚合酶的酶促作用，快速特异地扩增出特定的DNA片断。PCR技术简介-目的用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片断。由于PCR技术具有简单、快速、特异和灵敏的

2、特点，所以自1985年Mullis发明PCR技术和1988年Erlich发现耐高温的DNA聚合酶以来，该技术以惊人的速度广泛应用于生命科学的各个领域，特别是在细胞学、病毒学、肿瘤学、遗传病学、法医学、动植物免疫学等方面取得了巨大的成绩，成为当代分子生物学发展史上的一个里程碑。PCR技术简介-原理设计两段寡核苷酸引物，这两段寡核苷酸引物序列互不相同，并分别与模板DNA两条链上的各一段序列互补，而这两段模板序列由分别位于待扩增DNA区段的两侧。反应时，首先在摩尔数大大过量的两段引物及四种dNTP参与下对模板DN

3、A进行加热变性；随之，将反应混合液冷却到某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列退火；此后退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。如此反复进行变性、退火和DNA合成这一循环。PCR技术简介-原理由于一轮扩增的产物又充当下一轮扩增的模板，所以在这一周而复始的过程中每完成一个循环，就基本上使目的DNA产物增加一倍。这一指数反应的主产物是一段双链DNA，它的两个末端由寡核苷酸引物的5`端来决定，而长度则取决于两引物间的距离。PCR技术简介-原理PCR法的原理图PCR反应所用酶：早期的PCR方法采用大肠杆菌DNA聚合酶

4、I的Klenow片断催化退火的寡核苷酸引物进行延伸反应。由于该酶会在进行DNA变性的温度下失活，所以在每一轮合成反应中都须重新加1份酶。并且在扩增较长模板是效果不够理想，产率较低，有一些错配，导致产物大小不均一。PCR反应所用酶：耐热DNA聚合酶是从一种嗜热细菌－嗜热水生菌种提纯出来的，经95℃持续温育仍有活性，不会在加热变性中失活，故无需每轮反应都重新加酶，又由于寡核苷酸引物的退火和变性可以在更高温度下进行，使引物和模板间的误配大大减少，提高了扩增反应的特异性和产率，并且可以扩增更长的产物。现用的TaKa

5、RaTaqTaKaRaTaq是一种94kDa的高纯度耐热性DNA聚合酶，是把ThermusaquaticusYT-1株的DNApolymerase基因在大肠杆菌中表达后，分离提取得到的，与野生型DNApolymerase具有相同的功能。TaqDNA聚合酶的局限性：1.可信度(Fidelity)通常TaqDNAPolymerase的Fidelity并不高,PCR反应有时会出现错配(Misincorpora-tion)现象，因而PCR克隆、变异导入等实验中，需加以注意。2.扩增的DNA长度使用TaqDNAPol

6、ymerase进行PCR扩增时，通常可扩增几kbp的DNA，超过10kbp则比较困难。3.扩增量使用TaqDNAPolymerase进行PCR产物克隆及食品、环境卫生检验等时，扩增量常常达不到要求。反应体系:按照以下次序，将各充分在灭菌离心管中混合，灭菌水?μlMgCl2溶液(25mmol/L)1.5-2-2.5μl(1.5-2.0-2.5mmol/L)10×扩增缓冲液2.5μl4种dNTP混合物（2.5mmol/L）2.0μl20mmol正向引物（25pmol/ul，超纯水配制）1.0μl100pmol反

7、向引物（25pmol/ul，超纯水配制）1.0μl100pmolDNATaq聚合酶0.2μl2.5U模板DNA1.0μl<1μg总体积25μlPCR典型的反应条件循环变性退火聚合首轮循环94~95℃5分钟50℃2分钟72℃2分钟后续循环94~95℃1分钟50℃2分钟72℃2分钟末轮循环94~95℃1分钟50℃2分钟72℃10分钟引物设计原则：1.长度以15－30个碱基为宜。2.正向反向两条引物链之间的距离适中，一般使扩增出的片断在300-1100bp之间。如果使用RT-PCR检测RNA病毒，引物间距离以50

8、0bp最佳。片断过短影响结果判定，过长则不易扩增。3.引物碱基组成应随机分布，G+C含量在45-55％为宜。引物设计原则：4.引物自身不形成二级结构，引物间没有互补序列（4个碱基以上）。5.引物序列必须是被检病原微生物特异的。6.引物3`端碱基与模板DNA一定要配对，并且3`末端碱基最好选T`、C或者G，不选A。引物含量计算：1OD260单位DNA：是指在1ml体积1cm光程标准比色皿中，260nm波长下吸光度为