遗传与发育综合实验实验讲义

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1、遗传与发育综合实验讲义第一部分：分子标记技术系列实验：实验一RAPD标记实验内容：1DNA制备2PCR扩增3RAPD结果检测统计分析实验二SSR标记实验内容：1基因组DNA制备　2微卫星DNA的扩增3SSR标记检测分析实验三AFLP标记实验内容：1酶切与连接2选择性扩增3银染4目的DNA的回收第二部分植物基因克隆技术系列实验实验一利用RT-PCR技术分离目标cDNA片段实验内容：1cDNA合成2PCR扩增3筛选目标cDNA实验二mRNA差别显示技术实验内容：1RNA制备2逆转录3PCR差异显示mRNA4.测序胶分离PC

2、R产物5.银染6.结果与讨论第一部分分子标记技术系列实验遗传标记在遗传学的建立和发展中有着举足轻重的作用，同时也是作物遗传育种的重要工具。遗传标记主要分为:形态标记、细胞学标记、生化标记分子标记。分子标记则是DNA水平遗传变异的直接反映。DNA分子标记具有能对各发育时期的个体、各个组织、器官甚至是细胞作检测，既不受环境的影响，也不受基因表达与否的限制；数量丰富；遗传稳定；操作简便等特点。广泛应用。DNA分子标记使得基因组作图工作成了遗传学上描述细胞中所含遗传物质的一个简单概念，已形成了一门复杂的新兴学科—基因组学，其影响

3、之大不仅波及了生物学、医学和农业的各个方面，而且对社会也产生了巨大的冲击。RAPD（RandomAmplifiedPolymorphicDNA，其发音与英文字母“rapid”相同）技术是由美国杜邦公司的Williams和加里福尼亚生物研究所的Welsh于1990年同时发展起来的。核心技术都是通过PCR进行DNA扩增。第一单元：RAPD标记RAPD的基本原理：通过DNA扩增片段的多态性来检测DNA所发生的遗传变异。RAPD以检测DNA的多态性为目的，但它检查的不是限制性内切酶片段的多态性，而是PCR扩增DNA片段的多态性，这

4、种多态性反映了不同个体模板DNA的核苷酸变化。多态性产生的原因：一，模板中引物结合区的核苷酸变化导致扩增DNA片段多态性。二，扩增范围内的碱基插入、缺失、DNA重排等核苷酸变化导致扩增DNA片段多态性。1）取50-200mg新鲜叶片，置液氮中研磨成粉。2）将冻粉分配到两个1.5或2.0ml的离心管中,加入提取缓冲液900μl,轻轻搅动,。3）各加入100μlSDS，于65℃水浴中保温10-15min(间隔晃动2-3次)。实验操作:1.DNA制备4）各加入160μl5mol/LKAc,充分混匀，冰浴中放置30min。5）4℃

5、下12000rpm离心15min。6）上清转入新离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒离心管数次，放置片刻。7）4℃下8000rpm离心10min。8）上清转入另一离心管中，加入2/3倍体积、-20℃预冷的异丙醇，混匀，放置30min,观察DNA沉淀生成。9）4℃下8000rpm离心10min，倾去上清液，将离心管倒置于吸水纸上，控干上清液。10）用80%的乙醇洗涤沉淀，吹干10-15min。11）加入100μlTE缓冲液充分溶解沉淀（若溶解不好，可置37℃水浴中保温，促进溶解）。12）加入2μlRNase酶液，于3

6、7℃保温1h。13）加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，放置几分钟后10000rpm5min,重复一次。14）转移并量出上清液体积，置新离心管中，加入1/5倍体积的3mol/LNaAC,混匀，加入2.5倍体积的无水乙醇，轻缓混匀，室温放置数分钟。15）10000rpm离心5-10min，按9）操作，去尽上清液。16）用80%乙醇洗涤沉淀2-3次，吹干。加入10μlTE或dH2O溶解DNA，备用。1)在冰上做好针对不同DNA的100个PCR反应混合液（加样次序如下）：水1475μl10×缓冲液200μl10×dNTPS200μl

7、引物(20μmol/L)20μlTag聚合酶5μl终体积1900μl(分装100管)DNA（10-100ng）每管1μl2．PCR扩增：2)将反应混合液等量分装到反应管中。3)加入DNA或引物4)盖上小管，放到PCR仪上。5)进行PCR反应，采用3步PCR程序：a)1个循环94℃4min36℃1min72℃1.5minb)45个循环94℃1min36℃1min72℃1.5minc)72℃5min4℃保存3．RAPD结果检测：1）用1×TBE配2%琼脂糖凝胶。2）PCR结束后，每个样品中加入4μl凝胶上样缓冲液。每个泳道上样

8、20μl，选择合适的相对分子质量Maker（如λHindIII/EcoRI）。3）电泳。4）观察。第三单元：SSR标记在人类及动植物的基因组中,包括内含子、编码区及染色体上的任一区域,均存在着由1～6个碱基对组成的简单重复序列(simplesequencerepeats),简称SSR,又称之为微卫星DN