包涵体蛋白质复性-纯化

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1、包涵体蛋白复性和纯化策略MarketProportionbyHostCells(biopharmaceuticalproteinsor”Pharmateins”)Yeast:28%E.coli:54%Animalcell:21%E.coliinclusionbodyrouteoccupiesaboutahalf包涵体：在某些生长条件下，基因工程菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（InclusionBodies，IB）。包涵体的组成及特性一般含有50%以上的重组

2、蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。包涵体与蛋白种类及表达系统无关，仅为蛋白过量表达的结果。包涵体的形成在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。最大缺点：一级结构正确，高级结构错误。包涵体形成的主要原因1.表达量过高。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能完全正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。2.重组

3、蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体3.重组蛋白所处的环境：发酵温度高（37-42℃）或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。4.重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。包涵体表达的有利因素Advantages:1.可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。2.降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。有时甚至可以达到细胞总蛋白含量的30%3.包涵体中杂蛋白含量

4、较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。4.包涵体表达的蛋白质没有活性，细胞破碎和以后复性前的纯化步骤，不用考虑蛋白质的失活问题。1.对表达蛋白的胞内修饰过程不了解。2.要求复杂和精确的复性过程3.复性过程的收率往往很低，经常成为放大的瓶颈包涵体表达的不利因素Disadvantages:分离纯化细菌包涵体蛋白质的基本步骤：破碎细胞(Disruptionofcell)↓分离包涵体(Seperationofinclusionbody)↓溶解包涵体(Dissolveinclusionbody)↓蛋白质产物的构象复原

5、等。(Recoveryoftargetproteinconformation)包涵体的复性前准备洗涤：由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂如2M尿素在50mMTrispH7.0-8.5左右、1mMEDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。包涵体的溶解1.采用高浓度的变性剂，使其形成伸展的肽链。常用的变性剂有尿素（8M）、盐酸胍（GdnHCl6-8M），通过离子间的相互作用，破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。尿素的增溶效果稍差，异

6、氰硫酸胍（GdnSCN）最强。变性剂的使用浓度和作用时间：一般在偏碱性的环境中如pH8.0-9.0，尿素在碱性环境中不稳定。有些蛋白只能用盐酸胍。增溶时一般室温过夜，但盐酸胍在37度1小时便可以使多数蛋白完全变性溶解。2.去垢剂：如强的阴离子去垢剂SDS，可以破坏蛋白内的疏水键，避免蛋白形成疏水核心，可以增溶几乎所有的蛋白。但由于SDS无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用（研究）。3.极端pH：可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白。如在pH>9.0溶解牛生长激素和牛凝乳蛋白酶包涵体。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。这些方法只适合于少部

7、分蛋白的增溶。4.还原剂：由于蛋白间二硫键的存在，在增溶时一般使用还原剂。还原剂的使用浓度一般是50-100mMDTT，也有使用5mM浓度。实际，还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。含有半胱氨酸的蛋白质，需要加入还原剂巯基乙醇、二硫苏糖醇等。加入金属螯合剂EDTA去除金属离子。(伸展态)U→(中间态)I→(自然态)N↓A（包涵体）从中间体转变为天然态的过程比较缓慢。当溶液中离子强

8、度或变性剂浓度很低，又无其它辅助手段存在时，聚集趋势占主导地位，导致蛋白质的自发复性效率极低。蛋白质折叠的三态模型复性目的复性：通过缓慢去除变性剂（避免折叠中间体重新聚集）使目标蛋白从变性的完全伸展状态（？