《细胞与免疫学技术与原理》课件

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1、第二讲细胞培养技术二动物细胞培养可以在同一时期、相同条件、相似性状的条件下提供大量的实验样本，开展科学研究，相对耗资较少，因而成为生物制品、单克隆抗体和基因工程制品生产的重要手段。第一节动物细胞原代培养概念：从供体获得组织细胞为材料，进行首次培养，称为细胞的原代培养或称细胞的初代培养。原代培养的细胞特点：（1）原始性（2）不均一性理论：各种动物和人体内所有组织都可进行培养。实际：幼体组织尤其是胚胎组织比老年的易培养；分化程度底的组织比分化程度高的易生长；肿瘤组织比正常组织容易培养。一、取材常用取材方法举例：1、取体

2、液主要指取血液，血液是白细胞的主要来源。有指尖取血和静脉取血等方法。指尖取血2、取人体皮肤或活检材料（1）皮肤用75%酒精消毒；（2）用刮皮刀刮取表皮，以轻微渗血为界；（3）包扎伤口，伤口好后不留疤痕。这种取皮方法的优点是表皮细胞多，培养容易成功。如取活检组织（小儿包皮）须先准备含双抗的BSS液送入手术间，手术后储4℃冰箱。3、取内脏和实体瘤内脏除消化道外基本是无菌的，要明确和熟悉所需组织的类型和部位。实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染。怀孕母鼠4、取鼠胚17天的胚胎取完整鼠胚胎

3、步骤5、取各种动物材料先准备好一瓶含双抗的无菌PBS液，待处死动物后，迅速取出所需要的脏器组织，放入无菌PBS液内，尽快将实验材料送入超净工作台，进行细胞原代培养。从体内取出的各种组织均由众多的细胞和纤维成分组成，且结合十分紧密，为获取大量生长良好的细胞，必须把组织细胞分散开来，使细胞解离出来；能达到单细胞水平更好，同时并不使细胞受伤害。二、组织分离方法适用范围：血液、羊水、腹水和胸水等细胞悬液。方法：一般用500～1000r/min的低速离心，如果离心速度过大和时间太长，则易挤压细胞使之受损或死亡。分层液：分层液

4、根据细胞比重不同，使各类细胞相互分开的，红细胞比重为1.092，淋巴和大单核等白细胞比重为1.070，分层液适用于分离血中淋巴细胞。1、离心分离法离心前离心后Ficoll分层液离心后外周血细胞示意图2、机械分散法适用范围：某些软组织如脑、胚胎及一些肿瘤组织。组织消化法是在把组织经过切割处理后，再用生化手段进一步分散成细胞团或单个细胞然后加入培养液。制成细胞悬液，接种入培养容器中后，细胞容易生长增殖，如：3、消化分离法胰蛋白酶消化法胶原酶消化法EDTA消化法优点：组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，具有二倍

5、体遗传性状，供体来源充分、生物条件稳定的情况下，在一定程度上能反映在体状态。三、细胞原代培养方法1．组织块培养法怀孕母鼠17天的胚胎胚胎中取出的成体近端小肠把粘膜切成小块细胞培养板中贴壁培养组织块间距1厘米取小鼠肠粘膜细胞贴壁培养组织块培养法示意图翻转培养瓶的目的是为了使组织块微干涸，以利贴附和免从瓶壁脱落，但时间不易过长，超过4小时以上可能对组织有不利影响。2、消化细胞培养法单层培养的表皮细胞单层细胞培养示意图胰蛋白酶冷消化法胰蛋白酶热消化法消化得到的细胞沉淀，用培养液配制成细胞悬液，接种到培养瓶内水平放置，37

6、℃进行培养，每隔1～2天换培养液一次，培养一定的时间后，细胞在瓶底可长成一单层。单层培养的神经细胞（左）和内皮细胞（右）单层细胞培养的好处：（1）更换新鲜培养液比较容易，便于细胞从培养液摄取营养和排除代谢产物；（2）易于观察某些因子加到培养液内后的作用，以及从培养液中减去某些因子后对细胞生长的影响。（3）当细胞粘附在基底质上后，则更容易表达某些产物；（4）单层细胞培养更适用许多细胞系。（5）适合大量细胞培养。第二节动物细胞传代培养原代培养过程中要不断更换新鲜培养液以维持细胞的生长。待细胞生长到一定的限度时会产生接触

7、抑制，需要对细胞进行再培养。概念：由原代培养的细胞经消化分离后，从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为细胞传代培养或再培养。传代培养形成的细胞群称细胞系。细胞系虽然比原代培养物的细胞组成均一得多了，但它仍不是单一细胞。必须在细胞系的基础上进行单细胞的克隆化、筛选而形成细胞株。一、需要更换新鲜培养液的提示1、培养液的pH值下降2、细胞浓度3、细胞类型4、细胞形态学二、传代培养的确定1．细胞生长停滞，继而细胞出现脂肪滴、衰老或者组织块脱离基质漂流在培养液中。2．正常细胞生长贴满瓶

8、壁后，由于正常细胞表面具有接触抑制，因而细胞生长受抑制。3.肿瘤细胞生长可形成多层细胞。多层细胞中，在低层部位的细胞与培养液不能直接触，结果由于营养不足而生长停滞，甚至细胞呈片状脱离瓶底而漂浮在培养中。三、传代培养的方法1、单层细胞的传代培养（1）轻轻震荡法（2）用胰蛋白酶消化液处理（3）用EDTA溶液（4）机械刮削法消化法传代培养步骤悬浮细胞的传代培养，不